WWW.LIBRUS.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - собрание публикаций
 

«АНДРЕЕВ Дмитрий Евгеньевич СХОДНЫЕ ЧЕРТЫ В МЕХАНИЗМАХ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ У ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ ...»

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА .

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

АНДРЕЕВ Дмитрий Евгеньевич

СХОДНЫЕ ЧЕРТЫ В МЕХАНИЗМАХ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ

У ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова .

Научный руководитель:

доктор химических наук Иван Николаевич Шатский

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук Лариса Витальевна Мочалова доктор биологических наук, профессор Юрий Леонидович Дорохов

Ведущая организация:

Новосибирский институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Защита состоится " 27 " июня 2006 г. в 16— на заседании Диссертационного совета Д.501.001.41 при Московском Государственном Университете им. М.В .

Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова .

Автореферат разослан " 27 " мая 2006 года .

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук И.Г. Смирнова ^~/*~^^^"—""Сх' ^-^

Общая характеристика работы

проблемы. До недавнего времени считалось, что механизмы Актуальность инициации трансляции у прокариот и эукариот кардинально различны. Стандартные прокариотические мРНК полицистронны, перед каждым инициаторным триплетом располагается последовательность, комплементарная участку в 16S рРНК (последовательность Шайна-Дальгарно) и участок связывания рибосомного белка S1 .

Эукариотическая рибосома не имеет анти-ШД участка в составе 18S рРНК и не имеет функционального аналога S1, вот почему она не способна инициировать белковый синтез на прокариотической мРНК .

В отличие от бактериальных мРНК, стандартные эукариотические мРНК моноцистронны, на 5' конце находится "кеп", который привлекает факторы инициации и малую рибосомную субъединицу на 5' конец мРНК, затем следует предшествующая инициаторному кодону 5' НТО, которая сканируется рибосомой при содействии сканирующих инициаторных факторов. Другой уникальной особенностью эукариотических мРНК является поли-А последовательность на 3' конце мРНК .

Прокариоты, естественно, не имеют кеп-связывающего инициаторного фактора, также для них не обнаружены факторы, необходимые для сканирования, и поэтому они не способны транслировать подавляющее большинство эукариотических мРНК. Таким образом, посадка рибосомы на 5'конец (которая определяется кепом) и сканирование в поисках инициаторного триплета являются отличительными чертами эукариотической трансляции, а посадка на внутренний участок мРНК непосредственно в окрестности инициаторного триплета — отличительной чертой прокариотической трансляции .

В последнее десятилетие, однако, появились данные, которые похоже начали "перекидывать мостик" между механизмами инициации трансляции у эукариот и прокариот. Обнаружено, что эукариотические факторы инициации elF1, elF1A и elF5B являются структурными и функциональными аналогами бактериальных IF3, IF1 и IF2 .





Кроме того, оказалось, что для некоторых эукариотических мРНК, прежде всего вирусного происхождения, несомненно возможен механизм связывания рибосомы на их специфических внутренних участках. Такие участки получили название IRESэлементы (от англ. Internal Ribosome Entry Site). Однако следует подчеркнуть, что если в случае прокариотических мРНК внутренняя посадка рибосомы требует только белка S1 и/или наличия в них последовательности Шайна-Дальгарно, а также участия в процессе инициации только трех факторов инициации (IF1, IF2 и IF3), то IRESэлементы это протяженные участки с развитой вторичной структурой. Классические IRES-элементы РНК пикорнавирусов содержат высокоспецифические сайты связывания для инициирующих факторов, чего нет в бактериальных мРНК. Для инициации трансляции на таких элементах РНК пикорнавирусов требуются почти все эукариотические факторы инициации трансляции (за исключением кеп-связывающегс фактора elF4E) и ряд вспомогательных мРНК-связывающих белков. Гораздо большее сходство с бактериальной системой: обнаруживают IRES-элемент из РНК вируса гепатита С, который для образования 40S инициирующего комплекса (48S комплекс) обходится всего двумя факторами инициации, elF2 и elF3, и таким образом не требует ни кепа, ни процесса сканирования цепи мРНК при выборе инициирующего кодона. До недавнего времени IRES-элемент РНК ВГС, не считая совсем экзотического случая IRES-элемента РНК вируса паралича сверчка, где не нужны никакие факторы инициации трансляции и даже инициаторная Мет-тРНК, был по существу единственным примером, показывающим сходство в механизмах связывания мРНК у про- и эукариот .

В данной работе обсуждаются новые примеры, которые показывают очевидное сходство во взаимодействии • мРНК с рибосомами бактерий и эукариот (млекопитающих)..

:

• Цели исследования .

Показать, что ранее исследованный в нашей лаборатории универсальный 1 .

IRES-элемент RhPV способен направлять внутреннюю инициацию не только в бесклеточной системе, но и in vivo .

2. Проверить предположение, что эукариотическая 80S рибосома способна, подобно прокариотической 70S, связываться с безлидерной мРНК при отсутствии факторов инициации. В случае если предположение подтвердится:

3. Доказать функциональность полученного инициаторного комплекса

4. Сравнить два возможных для безлидерных мРНК пути инициации трансляции:

путь через образование 48S прединициаторного комплекса (который реализуется для подавляющего большинства мРНК), и путь через прямое образование 80S комплекса без участия факторов инициации

5. Изучить трансляционные свойства безлидерных мРНК в бесклеточной системе .

6. Определить структурные особенности безлидерных мРНК, которые необходимы для образования инициаторного комплекса с 80S рибосомой .

Научная новизна и практическая значимость работы .

Автор диссертации и его коллеги исходили из предположения, что постоянное сравнение не только структур рибосом или отдельных факторов трансляции, но и самих механизмов трансляции у бактерий и эукариот может быть весьма полезным для более глубокого понимания этого фундаментального процесса. Подробный анализ этих механизмов позволяет более четко выявить, что же в них является сходным, а что кардинально различным и тем самым сфокусировать внимание исследователей на еще совсем не исследованных проблемах .

Нами было показано, что внутренняя инициация трансляции для IRES-элемента РНК вируса черемуховой тли (RhPV) возможна не только в бесклеточных системах, но и in vivo — следовательно, ранее in vitro методом все данные, полученные реконструкции инициаторных комплексов из очищенных компонентов (совместно с И.М. Терениным) отражают "упрощенный" способ инициации трансляции, который напоминает инициацию трансляции у прокариот .

Основное Внимание в диссертационной работе было уделено изучению механизмов инициации трансляции безлидерных мРНК. Ранее в нашей лаборатории Балакиным и др, было показано, что безлидерная С1 мРНК фага А способна связываться с недиссоциированной прокариотической 70S рибосомой и инициаторной тРНК в отсутствие факторов инициации трансляции. В ходе данной работы было показано, что модельная безлидерная С1 мРНК способна связываться с 80S рибосомой и инициировать белковый синтез в отсутствие факторов инициации трансляции .

Установлено, что связывание безлидерной мРНК с 80S рибосомой обуславливается расположением инициаторного триплета на самом 5' конце мРНК и одноцепочечной конформацией мРНК непосредственно за инициаторным триплетом .

Чтобы приблизиться к пониманию механизма инициации трансляции безлидерных мРНК, который может реализовываться in vivo в условиях конкуренции с обычными

- мРНК и в присутствии полного набора факторов инициации, нами был проанализирован возможный "стандартный" механизм инициации через образование 48S предынициаторного комплекса. Методом реконструкции 48S комплексов из очищенных компонентов было показано, что фактор инициации elF1 оказывает дестабилизирующее влияние на 48S комплекс, собранный на безлидерной мРНК, что делает инициацию трансляции для безлидерной мРНК через связывание с 80S рибосомой предпочтительной .

Исследованные нами трансляционные свойства безлидерной мРНК в бесклеточной системе (ЛРК) представили весомые аргументы в пользу того, что в системе, в которой присутствуют все компоненты трансляционного аппарата, для безлидерной мРНК реализуется (хотя бы частично) фактор - независимый механизм инициации через связывание с 80S рибосомой .

Таким образом, в данной работе был предложен новый механизм инициации трансляции у эукариот и показана практически полная аналогия в связывании безлидерной мРНК с 70S и 80S рибосомами .

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ 29 марта 2006 г .

Материалы работы докладывались на международной конференции EMBO Conference on "Protein Synthesis and Translational Control", Германия, 2005 .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы .

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы, список литературы .

Материал иллюстрирован 13 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 243 цитированных работы .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Несмотря на то, что IRES-элемент RhPV способен направлять внутреннюю инициацию в бесклеточных системах, оставалось непонятным, способен ли он функционировать в клетках млекопитающих in vivo. Изучению этого факта посвящена начальная часть данной работы .

Основная часть данной работы была посвящена изучению механизма инициации трансляции безлидерных мРНК у эукариот. В качестве модельной мРНК нами была выбрана мРНК С1 фага А. Предпосылкой для такого выбора явился тот факт, что эта мРНК не имеет каких-либо прокариотических или эукариотических черт, а также то, что механизм инициации трансляции для этой мРНК в прокариотах детально изучен .

Нашей исходной гипотезой, вытекающей из параллели с прокариотическим способом инициации, было то, что безлидерная мРНК С1 способна связываться с эукариотической 80S рибосомой в отсутствие факторов инициации трансляции .

IRES-элемент вируса RhPV способен направлять внутреннюю инициацию in vivo • •*• В нашей лаборатории, в совместной работе с И.М. Терениным были исследованы свойства IRES-элемента вируса черемуховой тли RhPV, расположенного в 5-НТО геномной вирусной РНК. IRES-элемент RhPV обладает удивительной особенностью - • направлять внутреннюю инициацию трансляции в различных биологических системах .

Его универсальность объясняется тем, что этот IRES-элемент не имеет специфической структуры и специфических участков связывания компонентов трансляционного аппарата. Фактически он представлен протяженной неструктурированной U-богатой последовательностью. Это и объясняет, почему IRESэлемент RhPV способен связывать факторы инициации и 40S субчастицу рибосомы любого происхождения. Как было показано в опытах in vitro, посадка 40S субчастицы на инициирующий кодон этой мРНК возможна (хотя и с меньшей эффективностью) в отсутствие факторов 4-ой группы и гидролиза АТР, что совершенно нехарактерно для эукариот и, наоборот, демонстрирует сходство с прокариотическим механизмом инициации трансляции [terenin e t a ' i 2005]. Эта работа была продолжена в данной диссертационной работе, в которой были исследованы трансляционные свойства IRES-элемента RhPV как в бесклеточной системе, так и in vivo .

Подавляющее большинство работ по изучению трансляции in vitro делается в коммерчески доступной трансляционной бесклеточной системе - лизатате ретикулоцитов кролика, ЛРК. Однако для того, чтобы избежать неправильных интерпретаций результатов экспериментов в этой системе, необходимо учитывать ее недостатки .

При изучении трансляционных свойств другой мРНК, мРНК реторотранспозона человека LINE-1 в системе ЛРК нами было обнаружено, что инициация трансляции для такой мРНК происходит не только на аутентичном инициаторном кодоне, но и на других участках этой мРНК, приводя к образованию аберрантных продуктов трансляции. Известно, что ЛРК по сравнению о цитоплазмой содержит мало мРНКсвязывающих белков. Присутствующие в ЛРК факторы инициации трансляции способны, неспецифично связываясь с мРНК, вызывать образование инициаторных комплексов на таких инициаторных триплетах, которые не могут быть достигнуты рибосомой ни при кеп - зависимой, ни при IRES-зависимой инициации трансляции in vivo. При добавлении в ЛРК экстракта клеток HeLa наблюдалось исчезновение аберрантных продуктов трансляции для мРНК LINE-1, что, по всей видимости, связано с увеличением количества мРНК-связывающих белков, которые, связываясь с мРНК, не позволяют факторам инициации неспецифически связываться на внутренних участках этой мРНК. Таким образом, добавление экстракта клеток HeLa в ЛРК делает систему более адекватной для изучения мРНК с длинными 5'НТО .

Этот подход был применен нами и для изучения трансляционных свойств мРНК RhPV. Добавление экстракта клеток HeLa в ЛРК не подавляло трансляцию мРНК, содержащей этот IRES-элемент .

Однако для более строгого доказательства функционирования этого IRES-элемента в клетках млекопитающих нами был применен подход РНК-трансфекции. Поскольку вирус RhPV относится к РНК-вирусам, чей жизненный цикл проходит целиком в цитоплазме клеток хозяина, метод РНК-трансфекции является наиболее адекватным .

Действительно, при трансфекции клеток HeLa бицистронной мРНК, у которой межцистронная область представляла собой 5'НТО вируса RhPV, наблюдалась трансляция второго цистрона. Так, нормированное к трансляции первого цистрона (Renilla люцифераза) значение активности второго цистрона (Firefly люцифераза), в случае, когда межцистронная область представляла собой IRES-элемент RhPV, возрастало в 9,6 раза по сравнению с конструкцией, в которой межцистронной областью являлась последовательность вектора. Необходимо отметить, что активность этого IRES-элемента в клеточной линии 293 невелика, однако не стоит забывать, что такая вирусная последовательность изначально должна функционировать в клетках насекомых, и именно там следует ожидать проявления наибольшей активности данного IRES-элемента .

Таким образом, универсальный IRES-элемент RhPV способен функционировать и in vivo в клетках млекопитающих. Данный факт делает правомерным наш вывод о том, что такая мРНК демонстрирует необычный "упрощенный" и универсальный способ инициации трансляции, похожий на инициацию трансляции у прокариот .

Механизм инициации трансляции для безлидерных мРНК, не имеющей ни прокариотических, ни эукариотических черт, по предположению автора и его коллег должен был оказаться еще более схожим с механизмом инициации трансляции у прокариот. Его изучению посвящена основная часть работы .

–  –  –

gaugagcacaaaaaagaaaccauuaacacaagagcagcuu... 12 3 4 5 6 Рис. 1. Образование тройного комплекса 80S с С1 мРНК и Мет-тРНК„Мет .

А - метод центрифугирования в градиенте сахарозы. Направление седиментации обозначено стрелкой. Профиль пиков строился из значений радиоактивности, измерянных в каждой фракции градиента .

Б - метод тоу-принта. Положение полос сигнала тоу-принта и полноразмерной (ПР) кДНК обозначено стрелкой .

Замена 5' концевого инициаторного триплета AUG на GUG или на UAA (контроль) приводит к исчезновению тройного комплекса (дорожки 5 и 6). Поскольку в системе отсутствуют факторы инициации, которые способствуют разрушению "неправильных" инициаторных комплексов, то неспособность мРНК с GUG и UAA триплетом участвовать в образовании инициаторного комплекса с 80S рибосомой объясняется только менее стабильным кодон-антикодоновым взаимодействием мРНК с МетМет тРНК„ .

<

–  –  –

gaugagcacaaaaaagaaauaauuaacacaagagcagcuu... Для реконструкции стадии элонгации нами были выделены суммарные человеческие аа-тРНК синтетазы, с помощью которых была проаминоацилиррвана суммарная тРНК, кроме того, был очищен фактор элонгации eEF1H (eEF1A в комплексе со своим мультисубъединичным обменным фактором). Фактор элонгации eEF2 был любезно предоставлен Л.П. Овчинниковым. Нами была использована стратегия, при которой мы сначала собирали тройной инициаторный 80S комплекс, а затем добавляли в систему факторы элонгации, суммарную тРНК и GTP. Чтобы наблюдать стадию элонгации методом тоу-принта, седьмой триплет С1 мРНК был заменен на стоп-кодон (получена мРНК С1(стоп)). Седьмой триплет был выбран для того, чтобы исключить влияние изменяемой последовательности на образование инициаторного комплекса. Поскольку в системе отсутствуют факторы терминации, элонгирующая рибосома должна инвариантно останавливаться на мРНК со стопкодоном в А-сайте и предыдущим, 6 триплетом, в Р-сайте рибосомы. В этом случае мы должны были наблюдать возникновение сигнала тоу-принта на расстоянии +16-+18 нт от 6 триплета мРНК С1 (стоп) .

Действительно, добавление обоих факторов элонгации, суммарной аа-тРНК и GTP к инициаторному комплексу, собранному на С1(стоп) мРНК, приводило к появлению нового сигнала тоу-принта в предсказанной позиции (дорожка 4). При отсутствии какого либо из элонгационных факторов возникновение нового сигнала тоу-принта не наблюдалось (дорожка 2 и 3). Более того, при замене GTP на его негидролизуемый аналог GMPPNP также не наблюдалось возникновение сигнала тоу-принта (дорожка 5) .

GTP не нужен для образования тройного комплекса 808*С1-мРНК*Мет-тРНК„Мвт, но необходим для элонгации .

Представленные результаты все вместе подтверждают предположение о том, что комплекс, который образуется на безлидерных мРНК через прямое связывание с МеттРНК„ М 8 Т и 80S рибосомой, является функциональным .

Образование 48S инициаторного комплекса на С1 мРНК Поскольку в реальных условиях в клетке присутствуют все факторы инициации трансляции, мы решили определить эффективность образования 48S инициаторного комплекса на безлидерной мРНК, поскольку было необходимо оценить возможность реализации стандартного пути инициации трансляции. Все факторы инициации, которые необходимы для трансляции обычных клеточных кеп-зависимых мРНК, имеются у нас в виде индивидуальных компонентов .

Для инициации трансляции обычных кеп-зависимых мРНК необходимы следующие факторы инициации: elF1 (участвует в выборе инициаторного триплета, необходим для сканирования мРНК, разрушает нестабильные инициаторные комплексы), elF1A Мат (стимулирует посадку инициаторной Мет-тРНК„ в Р-сайт рибосомы, необходим для сканирования), elF2 (фактор инициации, связывающий инициаторную тРНК и направляющий ее в Р-сайт рибосомы), elF3 (фактор-°платформа", необходимый для взаимодействия компонентов инициации трансляции между собой), elF4F (мультисубъединичный комплекс, который необходим для связывания с 5' концом мРНК и для сканирования предынициаторным комплексом 5' нетранслируемой области мРНК в поиске инициаторного триплета: в процессе сканирования расплетаются вторичные структуры, мешающие движению рибосомы). Главная субъединица elF4F - elF4G, субъединица elF4E отвечает за связывание с кепом, а хеликаза elF4A отвечает за расплетание вторичных структур. Вспомогательный фактор elF4B увеличивает процессивность elF4A и абсолютно необходим для образования инициаторных комплексов на мРНК, содержащих в своих 5' нетранслируемых областях стабильные вторичные структуры .

Если полный набор канонических факторов инициации требуется для инициации трансляции на стандартных кеп-зависимых клеточных мРНК, то для некоторых мРНК показаны пониженные требования к некоторым факторам, например мРНК RhPV, мРНК вируса гепатита С, некоторые мРНК с нестркутурированными 5'НТО. Все эти случаи (единственное исключение - IRES элемент CrPV, расположенный в межгеномной области мРНК) имеют общую черту: всегда необходимы факторы инициации elF2 и elF3. ;

–  –  –

Рис. З Образование 48S инициаторного комплекса на С1 мРНК. .

Полноразмерная кД1Ж и сигналы тоу-принта 9 C м • -I - « 3 B • jTo^-принт обозначены спарва от геля. Выход инициаторного комплекса, рассчитанный как отношение сигнала V»

- • тоу-принта к общей интенсивности сигнала в дорожке, указан внизу геля. За 100% принят "~ выход' 48S комплекса в присутствии полного i—|—|—|—|—|—|—|—,—, 1 набора факторов инициации .

100 260 108 85 15 12 5 83 О ««о. »—»•«»,% При использовании этих 3 факторов инициации трансляции 48S инициаторный комплекс собирается примерно так же эффективно, как и 80S комплекс, получаемый при прямом связывании безлидерной мРНК 80S рибосомы (сравнить дорожку 4 и 8) .

Неожиданным фактом оказалась значительная стимуляция образования 48S инициаторного комплекса факторами 4-ой группы (сравнить дорожку 2 и 4) .

Полученный результат не согласуется с общепринятыми функциями фактора инициации elF4F. В мРНК С1 отсутствует 5' НТО, которую необходимо расплетать для успешного сканирования. Можно было бы предположить, что этот фактор инициации расплетает область после инициаторного триплета для успешной посадки рибосомы, однако известно, что область непосредственно после инициаторного кодона имеет одноцепочечную конформацию, и ее так же не нужно расплетать. Из дополнительного эксперимента (см. диссертацию) видно, что для такой стимуляции необходим гидролиз АТР и хеликазная реакция. Хотя изучение этого крайне интересного факта требует проведения дополнительной работы, мы предполагаем, что фактор elF4F ATPзависимо стимулирует укладку мРНК, расположенной после инициаторного триплета, в мРНК-связывающий канал рибосомы .

Важный результат был получен при добавлении в систему фактора инициации elF1 .

Прежде необходимо упомянуть о литературных данных по функции этого фактора инициации. При добавлении всех факторов инициации, кроме elF1, к искусственной мРНК, содержащей 2 инициаторных AUG триплета (один на самом 5' конце мРНК, после него, через 19 САА повторов - второй инициаторный триплет) наблюдалось образование инициаторных комплексов на 2 инициаторных триплетах. При добавлении недостающего фактора инициации elF1 наблюдалось полное исчезновение инициаторного комплекса на 5'-проксимальном AUG триплете .

В нашем случае добавление к факторам инициации elF1A, elF2 и elF3 недостающего elF1 никак не сказывалось на выходе инициаторного комплекса (дорожка 3). Однако если в системе присутствовал еще и elF4F, то наблюдалось резкое падение выхода инициаторного комплекса (дорожка 1). Различия с результатами лаборатории Т.В. Пестовой (а именно тот факт, что в нашей системе при добавлении elF1 не наблюдалось полное исчезновение инициаторного комплекса) мы объясняем тем, что наша мРНК имеет всего один инициаторный кодон, в то время как для мРНК с двумя инициаторными триплетами существуют альтернативы присутствие второго инициаторного кодона смещает равновесие в сторону полного исчезновения комплекса на 5' проксимальном инициаторном триплете и накопления инициаторного комплекса на втором инициаторном триплете .

Тот факт, что для дестабилизирующего влияния elF1 на сборку комплекса на 5' проксимальном инициаторном триплете безлидерной мРНК С1 необходим фактор инициации elF4F, оказался новым результатом. Мы считаем, что в случае, когда в системе присутствует и фактор инициации elF4F, и фактор инициации elF1, прединициаторный комплекс, связавшись с 5' концом С1 мРНК, начинает сканировать кодирующую часть этой мРНК до того, как произошло кодон-антикодоновое узнавание, и, не найдя подходящего инициаторного триплета, диссоциирует .

elF1 увеличивает процессивность такого сканирования за счет разрушения нестабильных комплексов в процессе продвижения прединициаторного комплекса по мРНК, и за счет этого и оказывает дестабилизирующее влияние на образование инициаторного комплекса на самом 5' конце мРНК. В отсутствии факторов инициации 4 группы сканирование тоже возможно, но с меньшей эффективностью. В этом случае более быстрой стадией по сравнению с "переходом к сканированию" оказывается установление кодонантикодонового взаимодействия на 5' проксимальном AUG кодоне .

В случае полного набора факторов инициации трансляции (за исключением elF4B мы не использовали его, поскольку в нашем случае речь точно не идет о каких либо стабильных вторичных структурах в мРНК) выход иницаторного 48S примерно равен выходу 80S комплекса, полученного при прямом взаимодействии 80S рибосомы с С1 мРНК и Мет-тРНК„ Мэт. Однако очевидно, что в реальной системе, в которой большое количество клеточных мРНК конкурируют между собой за факторы инициации трансляции, безлидерная мРНК, возможно, будет неконкурентноспособной в стандартном пути инициации трансляции, протекающем через образование 48S инициаторного комплекса. В этом случае единственной альтернативой для такой мРНК будет использование "бесфакторного" механизма инициации трансляции через прямое связывание с 80S рибосомой .

Необычные трансляционные свойства безлидерной мРНК С11ас2 .

Хотя нами было показано, что для безлидерной мРНК могут реализовываться два способа инициации трансляции, один - через образование 48S инициаторного комплекса, другой - через прямое связывание с 80S рибосомой, было неясно, какой же путь окажется предпочтительным в реальной системе, в которой присутствуют все компоненты трансляции, например, в бесклеточной трансляционной системе. лизата ретикулоцитов кролика (ЛРК) .

мРНК CilacZ устроена следующим образом: после инициаторного триплета, который находится на самом 5' конце этой мРНК (не считая G для проведения Т7транскрипции), расположены 13 триплетов мРНК С1 фага А, после которой следует кодирующая часть Р-галактозидазы. В результате трансляции такой мРНК получается полипептид размером примерно 60 кДа. Для того, чтобы оценить трансляционные свойства этой мРНК, был необходим адекватный контроль. В качестве контроля нами были получены две мРНК, которые представляли собой ту же самую CilacZ мРНК, но с добавленными 5' нетранслируемыми областями. В первом случае была добавлена полностью неструктурированная 5' НТО, представляющая собой 19 повторов САА триплетов - мРНК CAA-C1lacZ. Во втором случае была добавлена 5'НТО стандартной кеп-зависимой мРНК р-актина. Необходимо отметить, что у всех трех мРНК последовательности после инициаторного триплета были одинаковыми, что исключает влияние открытой рамки считывания на эффективность трансляции этих мРНК .

Увеличение уровня трансляции безлидерной мРНК С1 lacZ при повышении ее концентрации в бесклеточной трансляционной системе Известно, что для стандартных мРНК зависимость их уровня трансляции выглядит от концентрации выглядит следующим образом: вначале при увеличении концентрации наблюдается рост уровня трансляции до некоторого максимума, а затем при дальнейшем увеличении концентрации мРНК наблюдается ингибирование трансляции. Было показано (в том числе и в нашей лаборатории), что такое ингибирование прежде всего связано с тем, что некоторые факторы инициации трансляции являются РНК-связывающими. Такие РНК-связывающие белки помимо своих высокоспецифичных сайтов связывания с рибосомой и другими инициаторными факторами способны за счет своих РНК-связывающих свойств неспецифично связываться с мРНК, и таким образом, покидать пул активных факторов инициации .

При большой концентрации мРНК в системе такие факторы инициации начинают активно вытитровываться, остальные компоненты инициации оказываются не способны поддерживать высокий уровень трансляции, и наблюдается ее ингибирование .

–  –  –

Трансляция безлидерной мРНК CilacZ не зависит от кепа Все клеточные мРНК котранскрипционно кепируются. Хотя некепированные мРНК также способны транслироваться. (механизм неясен, так как и в этом случае наблюдается зависимость от 5' конца мРНК), эффективность трансляции таких мРНК несравненно ниже, чем у кепированных мРНК .

Для мРНК, содержащих в своих 5'НТО IRES-элементы, уровень трансляции никак не зависит от присутствия или отсутствия кепа на 5' конце. Независимость какой либо мРНК от присутствия кепа является очень сильным аргументом в пользу того, что трансляция открытой рамки считывания такой мРНК направляется IRES-элементом .

Кеп на 5' конце мРНК, как уже упоминалось выше, необходим для привлечения через фактор elF4F предынициаторного комплекса для последующего сканирования в поисках инициаторного триплета .

C1/acZ- caa-C1/acZ bAct-C1/acZ

–  –  –

Для производных мРНК CILacZ, как с полностью неструктурированным лидером САА19, так и с лидером мРНК р-актина, наблюдалась значительная стимуляция трансляция в случае, если эти мРНК были кепированы. Однако для безлидерной мРНК наблюдалось полное отсутствие эффекта кепирования на уровень трансляции .

Отсутствие этого эффекта можно объяснить только тем, что для данной мРНК не выполняется стандартный сценарий, при котором одной из важнейших стадий является связывание elF4F с 5' концом мРНК посредством взаимодействия его субъединицы elF4E с кепом .

Безлидерная мРНК CilacZ эффективно транслируется при частичной инактивации elF2 .

В стрессовых условиях клетке не выгодно поддерживать высокий уровень трансляции клеточных мРНК, поскольку это весьма энергоемкий процесс. Этого понижения уровня трансляции удается добиться инактивацией каких-либо компонентов инициации трансляции .

В случае вирусной инфекции в цитоплазме зачастую появляется вирусная двухцепочечная РНК .

Клеткой выработан защитный механизм, призванный остановить развитие зараженной клетки путем глобального подавления уровня трансляции и клеточных, и вирусных мРНК, для того чтобы инфицированная клетка была уничтожена до того момента, как новые вирусные частицы покинут ее. Протеин-киназа R (PKR) присутствует в цитоплазме в неактивной форме, после связывания в виде димера с двухцепочечной РНК активируется и фосфорилирует а-субьединицу фактора инициации elF2. Фосфорилированный elF2, связываясь со своим обменным фактором elF2B, не способен диссоциировать от него, и обменный фактор "запирается" в неактивной форме. Так как обменный фактор присутствует в значительном недостатке по сравнению с elF2, довольно быстро весь elF2 оказывается инактивированным, и за счет этого трансляция подавляющего большинства клеточных (и вирусных) мРНК драматически падает .

Как можно видеть из рис. 6, при инактивации elF2 в лизате ретикулоцитов кролика посредством добавления экзогенной двухцепочечной РНК наблюдается значительное понижение уровня трансляции мРНК с 5'НТО. Уровень ингибирования трансляции зависит от количества добавленной дцРНК. В случае безлидерной мРНК наблюдается лишь незначительное подавление ее трансляции .

То, что подавление трансляции мРНК с 5'НТО связано именно с фосфорилированием и инактивацией elF2, демонстрирует эксперимент по иммунопреципитации этого фактора инициации (рис. 6Б). Так как источником фосфата для фосфорилирования а-субьединицы elF2 служит фосфат из АТФ, добавление радиоактивно-меченого уЧ32Р]-АТР одновременно с добавлением дцРНК в лизат ретикулоцитов кролика позволяет оценить фософорилирование по авторадиограмме белкового геля (рис 6В) .

Б f* ДЦРНК т т -+

–  –  –

Рис.6 Трансляция безлидерной CILacZ мРНК и ее производной с 5'НТО рактина в бесклеточной системе трансляции, в которой инактивирован фактор инициации elF2 .

А-зависимость уровня трансляции безлидерной мРНК и ее производной с 5'НТО от количества добавленной в систему дцРНК, Б-иммунопреципитация еШ2 из ЛРК, в который .

была добавлена дцРНК и 7-[ Р]-АТР, гель покрашен Comassie Blue; Л и Т - легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина G, В - тот же гель, авторадиограмма (центральная и правая дорожка) Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансляция безлидерной мРНК, в отличие от ее производной с 5'НТО, в бесклеточной трансляционной системе слабо зависит от концентрации активного e!F2 .

Если рассмотреть все результаты, полученные при изучении трансляционных свойств безлидерной мРНК в ЛРК, то становится понятно, что инициация трансляции для этой мРНК протекает по нестандартному механизму. Полученные данные, хотя и не являются прямым доказательством нашей модели инициации трансляции через прямое связывание с 80S рибосомой, являются серьезными аргументами в ее пользу .

Свойства безлидерной мРНК С1, которые позволяют ей связываться с 80S рибосомой Для того, чтобы определить, какие именно особенности CMacZ мРНК позволяют ей связываться непосредственно с 80S рибосомой в отсутствии факторов инициации трансляции, мы решили проверить, способна ли 80S рибосома связываться как с уже имеющимися производными CMacZ мРНК с 5'НТО (3-актина и с искусственной 5'НТО CAAig, так и с другими производными этой мРНК с короткими 5'НТО, а также с искусственными безлидерными мРНК, полученными из природных мРНК путем удаления их 5'НТО. Нами были дополнительно получены две искусственные мРНК с короткими 5'НТО, за которыми следовал инициаторный триплет и кодирующая часть мРНК CilacZ. Одна из них содержала лидер GGGCCG (мРНК 5G-C1/acZ), другая - Абогатый лидер GAAAAG (мРНК 5A-C1/acZ) .

Из рис.8 видно, что добавление 5'НТО к безлидерной мРНК (даже полностью неструктурированной последовательности CAAig и коротких 6 нт лидеров) полностью ингибирует образование тройного инициаторного комплекса 80S*C1 lacZ мРНК*МетМет тРНК„, хотя в случае лидера GAAAAG и наблюдается незначительное образование такого комплекса .

–  –  –

'; Заключение В этой работе нами было рассмотрено два случая, при которой трансляционный эукариотический аппарат функционирует по механизму, напоминающему инициацию трансляции у прокариот .

В случае IRES-элемента вируса паралича сверчка RhPV нами было показано, что он способен направлять внутреннюю инициацию не только в бесклеточных трансляционных системах (имеющих свои недостатки), но и in vivo в клетках млекопитающих. Этот факт позволяет перенести результаты, полученные in vitro и говорящие об "упрощенном" способе инициации для такой мРНК, на реальную систему .

Основное внимание в данной работе было уделено изучению механизма инициации трансляции для безлидерных мРНК у эукариот. Главный вывод, который можно сделать из представленных выше данных, заключается в том, что безлидерная мРНК с неструктурированной областью непосредственно после инициаторного триплета способна к инициации трансляции, протекающей через связывание такой мРНК с 80S Мет-тРНК„ Мет .

недиссоциированной рибосомой и инициаторной Такой способ инициации не требует ни одного фактора инициации трансляции .

Как уже упоминалось выше, безлидерные мРНК были обнаружены и у прокариот, и у архей, и у эукариот. Особенно часто безлидерные мРНК используются у архей и в клеточных органеллах. Хотя среди клеточных мРНК высших эукариот лока не обнаружено безлидерных мРНК, одна из РНК вируса кори не имеет 5'НТО, но, по всей видимости, все же транслируется. Кроме того, систематический поиск таких мРНК затруднен и вряд ли предпринимался ранее. Если такая клеточная безлидерная мРНК будет обнаружена, в свете нашей работы это не станет очень удивительным фактом .

Хотя безлидерные мРНК, возможно, могут транслироваться и по стандартному механизму через образование 48S инициаторного комплекса, можно предположить, что в условиях жесткой конкуренции с большим количеством стандартных клеточных мРНК за компоненты инициации трансляции, находящиеся в недостатке, бесфакторный способ инициации может стать единственно возможным .

Тот факт, что прокариотическая 70S рибосома и эукариотическая 80S рибосома способна связываться с одной и той же безлидерной мРНК, говорит о том, что эта функция рибосомы сохранилась в процессе эволюции. Возможно, способность к трансляции безлидерных мРНК представляет собой реликт эволюции трансляционного аппарата, и самые первые рибосомы были способны транслировать только такие мРНК .

!Я выводы

1. Показано, что безлидерная С1 мРНК способна связываться с 80S рибосомой в отстутствие факторов инициации трансляции .

2. Установлено, что тройной комплекс, образуемый 80S рибосомой, С1 мРНК и МеттРНК й Мет, способен участвовать в элонгации трансляции, т.е. является полностью функциональным инициаторным комплексом .

3. Показано, что С1 мРНК способна образовывать 48S инициаторный комплекс с 40S рибосомой и факторами инициации трансляции, однако выход такого комплекса сравним с выходом тройного 80S инициаторного комплекса. Кроме того, показано, что фактор инициации elF1 способен частично дестабилизировать инициаторный комплекс только в том случае, если в системе присутствует фактор инициации elF4F, а также то, что elF4F оказывает стимулирующий эффект на образование 48S инициаторного комплекса в присутствии АТР и активного фактора инициации elF4A .

4. Изучены трансляционные свойства С1 мРНК в бесклеточной системе трансляции ЛРК - показано, что трансляция С1 мРНК не ингибируется при повышении ее концентрации, что трансляция С1 мРНК не зависит от присутствия кеп-структуры на 5'конце, и что С1 мРНК способна эффективно транслироваться при инактивации elF2 .

5. Показано, что расположение инициаторного триплета на самом 5' конце мРНК и одноцепочечная конформация области непосредственно после инициаторного триплета являются определяющими факторами, позволяющими мРНК непосредственно связываться с 80S рибосомой в отсутствии факторов инициации трансляции .

6. Исследована трансляция неспецифического IRES-элемента вируса насекомых (RhPV) in vivo и в усовершенствованной бесклеточной системе. Полученные данные подтверждают кеп-независимый способ инициации трансляции на РНК RhPV, сходный с прокариотическим механизмом инициации трансляции .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. D.E. Andreev, I.M. Terenin, Y.E. Dunaevsky, S.E. Dmitriev, I.N. Shatsky (2006) A Leaderless mRNA Can Bind to Mammalian 80S Ribosomes And Direct Polypeptide Synthesis in the Absence of Translation Initiation Factors. Mol. Cell. Biol., 26, 3164-3169 .

2. I.M. Terenin, S.E. Dmitriev, D.EAndreev, E. Royal, G.J. Belsham, L.O. Roberts (2005) A "cross-kingdom" IRES reveals a simplified mode jf internal ribosomal entry. Mol. Cell.Bio]., 25, 7879-8B .

3. С Е. Дмитриев, Н.В. Быкова, Д.Е. Андреев, И.М. Теренин (2005) Адекватная система для изучения инициации трансляции мРНК ретротранспозона L1 человека in vitro. Мол.Биол., 40, 25-30

4. D.E. Andreev, I.M. Terenin, Y.E. Dunaevsky, S.E. Dmitriev, I.N. Shatsky (2005) A Leaderless mRNA Can Bind to Mammalian 80S Ribosomes And Direct Polypeptide Synthesis in the Absence of Translation Initiation Factors. EM BO Conference on "Protein Synthesis and Translational Control", 14-18 September 2005, Germany Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ»

Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус .

www.stprint.ru e-mail: zakaz(@stprint.ru тел.: 939-33-38




Похожие работы:

«ЗАО "Сбербанк-АСТ" Исх.24/2017 от 30 мая 2017г. ТЕХНИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ НА ПОСТАВКУ 1. Предмет закупки: поставка питьевой бутилированный воды (19 литров) ( далее "Вода" или "Товар" ) для нужд ПАО АФК "Система" и его Дочерних и зависимых компаний (далее – "ДЗК") согласно Приложения №1 к настоящему Техническому заданию (далее – "ТЗ"). На...»

«ВЕСТН. САМАР. ГОС. ТЕХН. УН-ТА. СЕР. ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ. 2017. № 2 (54) Электротехника УДК 621.316.9:683.06 МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ РЕЖИМОВ СЕТЕЙ ПРИ НЕСИММЕТРИИ ИХ ПАРАМЕТРОВ И НАГРУЗОК Н.С. Бурянина1, Ю.Ф. Королюк2, Е.В. Лесных3, Р.О. Гоголев1, К.В. Суслов4 Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова Ро...»

«ФОРМА ПРОЕКТНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ ДЛЯ СОВМЕСТНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ МАЛОМАСШТАБНЫХ ПРОЕКТОВ – Редакция 01.1 1 Комитет по надзору за совместным осуществлением ФОРМА ПРОЕКТНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ДОКУМЕНТАЦИИ ДЛЯ СОВМЕСТНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ МАЛОМАСШТАБНЫХ ПРОЕКТОВ Реда...»

«Масло моторное универсальное всесезонное Gazpromneft РПБ № 84035624.02.38633 стр. 3 Premium N 5W-40 по СТО 84035624-179-2015 Действителен до 14.07.2020 г. из 16 1 Идентификация химической продукции и сведения о производителе и/или поставщике 1.1 Идентификация химич...»

«Инструкция по установке, эксплуатации и техническому обслуживанию Изделия ТИПА 380/390 Большая Пропускная Способность, Нержавеющая Сталь Воздушный фильтр с регулятором и регулятор (КонтролЭйр) ВВЕДЕНИЕ Воздушный фильтр с регулято...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Инженерная школа природных ресурсов (ИШПР) Направление подготовки (специ...»

«Недавний Игорь Олегович РАДИОМЕТРИЧЕСКИЙ ГАММА-КОНТРОЛЬ БИНАРНЫХ ОБЪЕКТОВ" 05.11.13 приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Томск-2006 РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ТОМСКОМ ПОЛИТЕХНИЧЕСК...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТОМСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ" Школа базовой инженерной подготовки Специальность 38.05.02 "Таможенное дело" Отделение социально-гуманитарных...»







 
2019 www.librus.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - собрание публикаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.