WWW.LIBRUS.DOBROTA.BIZ
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - собрание публикаций
 

Pages:   || 2 |

«Ванюшкина Анна Алексеевна ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАБОЛОМА БАКТЕРИЙ КЛАССА МОЛЛИКУТ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

«Научно-исследовательский институт физико-химической медицины

Федерального медико-биологического агентства»

(НИИ ФХМ ФМБА)

На правах рукописи

Ванюшкина Анна Алексеевна

ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАБОЛОМА БАКТЕРИЙ КЛАССА МОЛЛИКУТ ПОД

ВОЗДЕЙСТВИЕМ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ

03.01.04 – Биохимия

диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Камашев Д. Э .

Москва, 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Актуальность работы

Цель работы

Научная новизна и практическая значимость работы

Апробация работы

Личный вклад автора

Объем работы

Публикации

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Особенности метаболизма молликут

2.2 Реконструкции карт метаболизма исследуемых организмов

2.3 Основные методы, используемые для анализа метаболитов бактерий............. 25 2.3.1 Тушение метаболизма и экстракция метаболитов

2.3.2 Методы разделения и анализа метаболитов

2.3.2.1 Газовая хроматография

2.3.2.2 Капиллярный электрофорез

2.3.2.3 Жидкостная хроматография

2.3.2.4 Выбор оптимальных условий проведения хроматографического разделения метаболитов

2.3.3 Детектирование и идентификация метаболитов

2.4 Обработка данных и интерпретация результатов анализа метаболитов........... 51 2.4.1 Обработка полученных данных

2.4.2 Способы интерпретации полученных результатов

2.5 Оценка адаптационных возможностей бактерий с применением метаболомного анализа

2.5.1 Применение качественного анализа метаболитов

2.5.2 Применение количественного анализа метаболитов

2.6 Перспективы метаболомики

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Штамм бактерий и условия культивирования

3.2 Определение устойчивости культуры к кислотному и осмотическому воздействию

3.2.1 Определение устойчивости культуры к кислотному воздействию......... 69 3.2.2 Определение устойчивости культуры к осмотическому воздействию.... 69

3.3 Химические реактивы

3.4 Экстракция метаболитов

3.5 Инструменты и ВЭЖХ-МС параметры

3.6 Идентификация метаболитов и программное обеспечение

3.7 Сравнительный анализ метаболомов S. melliferum, M. gallisepticum и A .

laidlawii

3.8 Выравнивание аминокислотных последовательностей

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Анализ метаболома бактерий A. laidlawii, S. melliferum и M. gallisepticum.. 76

4.2 Реконструкция метаболизма S. melliferum, M. gallisepticum и A.laidlawii...... 77 4.2.1 Удаление реакций из первичной схемы метаболизма

4.2.2 Реакции, приводящие к образованию «мертвых концов» в схеме метаболизма

4.2.3 Заполнение пробелов в схеме метаболизма

4.2.4 Выявленные особенности метаболизма молликут

4.3 Пентозофосфатный путь в клетках молликут





4.4 Составление списков возможных внутриклеточных метаболитов исследуемых видов молликут

4.5 Детектирование метаболитов трех видов молликут с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС

4.6 Идентификация метаболитов бактерий A. laidlawii, S. melliferum и M .

gallisepticum

4.7 Сравнительный количественный анализ метаболомов трех видов M .

gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum

4.8 Накопление метаболитов относительно компонентов отдельных метаболических путей S. melliferum, M. gallisepticum и A. laidlawii

4.9 Влияние аминокислотных замен на активность ферментов

4.10 Исследование адаптации молликут к кислотному воздействию................ 113

4.11 Исследование адаптации молликут к осмотическому воздействию.......... 120

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. БЛАГОДАРНОСТИ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Выравнивание аминокислотных последовательностей ферментов

–  –  –

МС - масс-спектрометрия ГХ- газовая хроматография HILIC - жидкостная хроматография на основе гидрофильного взаимодействия ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография УВЭЖХ - ультра высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ-МС/МС - комплекс высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии RMS - комбинационная микроспектроскопия SIMS - масс-спектрометрия вторичных ионов Q/ QQQ - квадрупольный масс-спектрометр/ тройной квадрупольный массспектрометр i-TRAP- масс-спектрометр типа ионная ловушка TOF - времяпролетный масс-спектрометр Q-TОF - квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр FTICR- масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурьепреобразованием ЯМР- ядерный магнитный резонанс EC - классификация ферментов ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ФАД - флавинадениндинуклеотид ФМН - флавинмононуклеотид НАДФ/НАДФH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат/восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата НАД/НАДН - никотинамидадениндинуклеотид/ восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида АМФ - аденозинмонофосфат АДФ - аденозиндифосфат АТФ - аденозинтрифосфат дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат ГМФ - гуанозинмонофосфат ГДФ - гуанозиндифосфат ГТФ - гуанозинтрифосфат УМФ - уридинмонофосфат дУТФ - дезоксиуридинмонофосфат дУДФ - дезоксиуридиндифосфат ЦМФ - цитидинмонофосфат дTДФ - дезокситимидиндифосфат дТТФ - дезокситимидинтрифосфат

Актуальность работы

Термин «системная биология» подразумевает комплексное исследование сложных биологических систем на различных уровнях их организации .

Системная биология, как относительно новая дисциплина, призвана интерпретировать уже накопленные и вновь получаемые экспериментальные данные для понимания принципов организации живого и способности организмов к адаптации при изменении условий окружающей среды. Метаболомика, являющаяся частью системной биологии, предоставляет новые возможности для достижения этой цели [1]. Развитие методов, позволяющих идентифицировать и количественно оценивать метаболиты клетки, позволяет расширить наши представления о биологических процессах в клетке. Исследования метаболического профиля организма позволяют получить мгновенный «снимок»

клеточной активности и выявить новые взаимосвязи между закономерностями репликации, транскрипции и трансляции функционально сложных мультиферментных систем .

Одним из направлений системной биологии, использующих метаболомный анализ, является исследование принципов организации биологических объектов, характеризующихся ограниченной генетической информацией (малым размером генома) и, следовательно, небольшими ресурсами регуляции. Проведение метаболомных исследований организмов с наиболее просто устроенным метаболизмом позволяет не только дополнять существующие данные, но и моделировать различные условия жизнедеятельности бактерии с целью определения механизмов адаптации. В качестве модельного объекта в данной работе были выбраны три вида бактерии класса молликут- Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma melliferum, Mycoplasma gallisepticum. Ключевым моментом в использовании молликут в качестве модельного объекта стала простота их устройства. Бактерии класса молликут (также называемые микоплазмами) представляют собой виды одноклеточных организмов, способные автономно реплицироваться на искусственных питательных средах. Молликуты ведут паразитический образ жизни и имеют в естественной среде обитания одного или нескольких хозяев Эти микроорганизмы являются основными [2] .

возбудителями ряда респираторных и урогенитальных инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе пневмонии и уретрита. Для молликут характерны: значительно редуцированный геном, размеры которого варьируются от 580 тыс. до 1.4 млн. пар оснований, низкое содержание Г-Ц оснований (31 % для M. gallisepticum), отсутствие клеточной стенки и большинства ферментов, ответственных за биосинтез метаболитов. Между тем, ограниченный метаболизм молликут не является препятствием для их адаптации и выживания в разных условиях. Накопленные данные об отсутствии у молликут некоторых систем ферментативной регуляции наряду со способностью клеток адаптироваться к различным условиям роста, делают их удобным модельным объектом для изучения принципов организации и механизмов адаптации минимальной живой системы на метаболическом уровне .

Исследования метаболома простейших бактерий позволяют выявить соединения и метаболические пути, которые необходимы для их жизнедеятельности. Так, метаболомные исследования, проведенные для бактерий Mycoplasma pneumoniae, позволили не только построить точную модель метаболизма этих организмов, прогнозирующую поведение клетки в различных условиях, но и определить минимальный состав искусственной питательной среды, необходимой для культивирования этих бактерий [3]. Идентификация основных метаболитов и анализ изменения их внутриклеточной концентрации при различных воздействиях предоставляет исследователям возможность выявлять механизмы регуляции биохимических процессов в клетке. Результаты анализа внутриклеточных метаболитов, взятые вместе с данными протеомного анализа и данными аннотирования генов, позволили нам выявить потенциальные механизмы адаптации A. laidlawii, S. melliferum, M. gallisepticum к внешним воздействиям и определить особенности метаболизма каждого вида бактерий .

Цель работы Исследовать метаболом трех видов молликут - M. gallisepticum, S .

melliferum, и A. laidlawii при культивировании клеток в оптимальных лабораторных условиях, а также при адаптации к кислотному и осмотическому внешним воздействиям .

–  –  –

1. Реконструировать метаболические карты A. laidlawii, S. melliferum, M .

gallisepticum и составить базы данных внутриклеточных метаболитов для каждого вида .

2. Выбрать и отработать оптимальные условия для проведения анализа метаболитов в клетках молликут с использованием ВЭЖХ-МС/МС метода и провести анализ метаболома бактерий A. laidlawii, M. gallisepticum, S .

melliferum, культивируемых в оптимальных условиях .

3. Сопоставить между собой данные метаболомного анализа для S. melliferum, A.laidlawii и M. gallisepticum и выявить особенности метаболизма каждого вида .

4. Провести сравнительный анализ относительных концентраций метаболитов в клетках M. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum .

5. Сопоставить данные о накоплении метаболитов с аминокислотными заменами в активных центрах ферментов S. melliferum, М. gallisepticum, А .

laidlawii, катализирующих реакции с участием накапливающихся метаболитов для анализа влияния таких замен на активность ферментов .

6. Провести анализ изменения метаболома бактерий S. melliferum, A. laidlawii и M. gallisepticum в условиях кислотного и осмотического воздействий для выяснения способов адаптации бактерий к осмотическому и кислотному воздействиям .

Научная новизна и практическая значимость работы

Настоящая работа направлена на изучение принципов организации минимальной живой системы на метаболическом уровне при исследовании бактерий класса молликут. Молликуты являются возбудителями инфекционных заболеваний человека, сельскохозяйственных животных и растений, поэтому исследование принципов регуляции их метаболизма имеет не только фундаментальную, но и практическую значимость для здравоохранения и сельского хозяйства. Демонстрация активации уникальных метаболических путей в клетках микоплазм позволит использовать их в качестве мишеней при разработке новых лекарственных средств .

С помощью метода гидрофильной хроматографии, совмещенной с времяпролетной масс-спектрометрией, в работе был впервые проведен анализ метаболома бактерий класса молликут и реконструированы карты метаболизма трех исследуемых видов. Кроме того, впервые был охарактеризован метаболом клеток A. laidlawii, S. melliferum, M. gallisepticum в нормальных условиях и в условиях кислотного и осмотического воздействия .

Благодаря полученным данным удалось определить различия в механизмах регуляции трех видов молликут на метаболомном уровне и предложить механизмы биохимической адаптации молликут к внешним воздействиям .

Показаны отличия в механизмах приспособления к внешним воздействиям между S. melliferum, A. laidlawii и M. gallisepticum. Определены особенности метаболизма каждого вида. Полученные данные могут быть использованы для создания новых противомикробных препаратов, с учетом специфики организации метаболизма клеток разных видов молликут .

Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференции молодых ученых НИИ Физико-химической медицины (Москва, 23-24 мая 2012 г.); на конференции Европейской молекулярно-биологической организации (Хайдельберг, 17-20 ноября 2012 г.); конференции молодых ученых НИИ физико-химической медицины (Москва, 28-29 мая 2013 г.); 9-ой ежегодной конференции метаболомного сообщества (Глазго, 1-4 Июля 2013 г.); 38ом конгрессе федерации европейских биохимических обществ (СанктПетербург, 6–11 ноября 2013 г .

–  –  –

Все экспериментальные научные результаты, изложенные в диссертации, их анализ, обобщение литературных данных и оценка результатов выполнены лично автором под руководством Камашева Д.Э .

–  –  –

Диссертация содержит следующие разделы: введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты и дискуссия, заключение, выводы, благодарности, список литературы и приложение.

Работа изложена на 163 страницах, содержит 8 таблиц и 17 рисунков .

–  –  –

По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ, из которых 3 статьи в международных рецензируемых изданиях и 5 публикаций в трудах конференций .

1. ВВЕДЕНИЕ Системная биология призвана интерпретировать уже накопленные и вновь получаемые экспериментальные данные геномного, транскриптомного, протеомного и метаболомного анализа для понимания принципов организации организма и его способности к адаптации при изменении условий окружающей среды. В настоящий момент полностью расшифрованы и аннотированы более четырех тысяч геномов различных микроорганизмов. Для большинства видов бактерий уже получены данные протеомного и транскриптомного анализа .

Однако данные о транскрипции мРНК, расшифровка ДНК-последовательностей и данные протеомного анализа не раскрывают полностью всех процессов, происходящих в клетках. Метаболомика, как часть системной биологии, предоставляет новые возможности для исследования принципов организации живой системы. Анализ метаболома является трудоемкой задачей и требует индивидуального подхода при изучении каждого конкретного микроорганизма, поэтому наиболее полные метаболомные данные, на сегодняшний день, получены лишь для хорошо изученных видов. Однако именно метаболический профиль организма представляет собой тот конечный результат клеточной активности на всех остальных уровнях регуляции, который позволяет объединить все накопленные многоуровневые «омные» данные для получения целостного представления об организме .

Несмотря на аннотирование полных геномов множества микроорганизмов, функции многих генов остаются неизвестны и многие преобразования в клетке катализируются неопределенными ферментами. Наиболее простой подход для решения задачи функциональной аннотации гена разработан на основании метаболомного анализа. Такой метод заключается в анализе изменений концентраций метаболитов в «нокаутных» штаммах (то есть штаммах с делецией определенного гена) [4, 5]. Для такого штамма ожидаемым изменением в метаболоме является накопление субстратов реакций, катализируемых соответствующим удаленному гену ферментом. Детектирование накоплений метаболитов в клетках при делеции гена позволяют точно функционально аннотировать ген Исследование метаболитов позволяет также [6-8] .

охарактеризовать важнейшие пути метаболизма на уровне взаимосвязей между низкомолекулярными компонентами клетки и выявить новые пути протекания превращений метаболитов в клетке [9]. Так, группа ученых под руководством профессора Пейрауда в 2009 году продемонстрировала наличие каждого из метаболитов предполагаемого пути биосинтеза глиоксилата в клетках организма Methylobacterium extorquens [10]. Кроме того, выявление компонентов уже изученных метаболических путей является доказательством наличия активности соответствующего пути в клетках [11]. Например, в перспективном, с точки зрения биоэнергетики, организме Clostridium acetobutylicum, наличие цитрата в клетках послужило доказательством существования функционального цикла трикарбоновых кислот, несмотря на недостаток аннотированных ферментов [12] .

Метаболомика является мощным инструментом количественной оценки динамики изменения содержания метаболитов. Такие данные могут расширить наше понимание механизмов адаптации организмов к различным условиям окружающей среды и выявить принципы взаимодействия патогенных микроорганизмов с хозяином [13-15]. Данные метаболомного анализа, взятые в совокупности с протеомными, транскриптомными и геномными данными позволяют реконструировать максимально приближенные к реальным объектам модели метаболизма. Построение точных моделей метаболизма является необходимым условием для прогнозирования поведения микроорганизма в различных условиях [16] .

Для получения представления о механизмах регуляции фундаментальных биохимических процессов в клетке объектом исследования часто выбирают простейшие микроорганизмы, поскольку моделирование их метаболизма и интерпретация полученных результатов представляет собой более простую задачу, чем в случае использования в качестве модели клеток эукариот .

Метаболизм бактерий устроен значительно проще, чем метаболизм эукариот, так как в состав их метаболома входит значительно меньше компонентов. На сегодняшний день расшифрованы последовательности генома нескольких тысяч видов бактерий. Прямые связи между метаболитами, катализируемые ферментативными преобразованиями, подробно отображены в существующих базах данных метаболических путей, что упрощает задачу реконструкции единой схемы метаболизма выбранного организма и интерпретации полученных результатов. В качестве объектов исследований в данной работе были выбраны три вида бактерии класса молликут- A. laidlawii, S. melliferum, M. gallisepticum .

Молликуты являются удобными модельными объектами для исследования минимальной живой системы, так как им свойственны предельная простота устройства клеток, отсутствие большинства путей биосинтеза, но в тоже время, способность адаптироваться к различным условиям культивирования. Для исследования принципов организации минимальной живой системы на примере молликут в работе были поставлены следующие вопросы: какие особенности метаболизма бактерий позволяют им адаптироваться к изменению условий окружающей среды, какие регуляторные механизмы приводят к оптимизации состояния клетки в различных условиях, в чем отличие механизмов адаптации в организмах близкородственных видов, проявляющих строгую специфичность к организму-хозяину? Метаболомика, как область системной биологии, направлена на решение этих вопросов благодаря возможности объяснить физиологические процессы с точки зрения согласованных взаимодействий многочисленных биохимических реакций. Поэтому исследование метаболизма микроорганизмов в настоящее время является одной из самых актуальных областей развития системной биологии, позволяющей выяснить фундаментальные закономерности, возможно, действующие и в более сложных живых системах .

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

–  –  –

Ключевым моментом в выборе молликут в качестве модельных объектов стала простота устройства их клеток и способность бактерий этого класса адаптироваться к различным условиям роста. Класс молликут представляет собой гетерогенную группу микроорганизмов, объединяющую микоплазмы, ахолеплазмы, спироплазмы, уреаплазмы, анаэроплазмы и термоплазмы .

Представителей класса молликут характеризует ряд особенностей, уникальных для прокариот: отсутствие клеточной стенки и ее предшественников; наименьший среди прокариот размер генома (0,5-1,2 млн.

п.н.); самое низкое относительно других микроорганизмов соотношение Г-Ц пар оснований в ДНК; чрезвычайно простая организация клетки, имеющей минимальное количество органелл:

цитоплазматическую мембрану, более похожую на мембрану клеток эукариот, прокариотический нуклеоид и рибосомы; присутствие холестерина и его эфиров в плазматической мембране [17-19]. Проведение метаболомных исследований организмов с наиболее просто устроенным метаболизмом позволит не только дополнить существующие данные, но и моделировать различные условия их жизнедеятельности с целью определения механизмов адаптации к ним .

Объектами исследований были выбраны три вида бактерий класса молликут melliferum, Mycoplasma gallisepticum, и Acholeplasma laidlawii,

- Spiroplasma являющиеся близкими родственниками, но имеющие отличия в специфичности по отношению к организму-хозяину и в некоторых метаболических путях .

Представители класса молликут очень широко распространены в природе как паразиты человека и других млекопитающих, птиц, рыб, моллюсков, насекомых, растений [20]. Их метаболизм зависит от клетки-хозяина, с которой они тесно связаны [19]. Микоплазмы проявляют строгую специфичность к организму-хозяину, нередко и тканеспецифичность. Однако существуют многочисленные примеры обнаружения Микоплазм в организмах и тканях, отличающихся от обычных мест обитания бактерий [20]. Основные места обитания Микоплазм в человеке и животных - слизистые поверхности дыхательных путей и урогенитального тракта, глаза, желудочно-кишечный тракт, молочные железы, и суставы. M. gallisepticum - возбудитель хронических респираторных заболеваний кур и индеек. S. melliferum является патогеном насекомых и инфицирует медоносных пчел [21]. Спироплазмы и фитоплазмы широко распространены в кишечнике, гландах и слюнных железах членистоногих. A. laidlawii способна заражать клеточные культуры и имеет широкий спектр хозяев, в том числе крупный рогатый скот, человек, птицы и растения, а первоначально этот вид бактерий был выделен из сточных вод [22-26] .

Генетически редуцированные организмы имеют ограниченную приспособляемость к внешним факторам, однако за счет паразитического образа жизни молликуты обладают мощными адаптивными способностями [27] .

Сравнение между собой метаболомов разных видов молликут может помочь выявить минимальные адаптивные функции простейших бактерий .

Метаболическая активность молликут, по всей видимости, направлена в первую очередь на производство энергии и выживание в изменяющихся условиях окружающей среды, а не на накопление субстратов для внутриклеточного биосинтеза. У микоплазм отсутствует большинство биосинтетических систем, взамен они используют метаболический аппарат организма-хозяина. Так, M .

genitalium (близкий родственник исследуемых видов) имеет только один ген, ответственный за ферменты биосинтеза аминокислот, и несколько генов, ответственных за ферменты синтеза предшественников витаминов и нуклеиновых кислот [28]. У молликут отсутствуют гены, кодирующие ферменты биосинтеза жирных кислот, что ведет к зависимости микоплазм от внешнего источника этих веществ и дает возможность в эксперименте манипулировать составом жирных кислот в плазматической мембране [19] .

В метаболизме микоплазм отсутствует цикл трикарбоновых кислот, синтез многих аминокислот, а также синтез пуринов и пиримидинов [29]. Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК или цикл Кребса), возможно, самый важный центральный метаболический путь в живых клетках .

Этот путь играет основную роль в производстве энергии и в биосинтезе ключевых промежуточных соединений для анаболических реакций. Несмотря на значимость этого цикла, многие бактерии, особенно патогенные микроорганизмы, имеют неполный ЦТК (например Pyrococcus horikoshii, Synechocystis, Rickettsia prowazekii), а у некоторых организмов (например, у исследуемых нами микоплазм), геномная аннотация ферментов этого цикла полностью отсутствует. Кроме исследуемых нами бактерий класса молликут, полное отсутствие аннотированных ферментов ЦТК показано также для Mycobacterium genitalium и Treponema pallidum [30] .

В геноме всех видов молликут отсутствуют ферменты, катализирующие de novo синтез пуриновых и пиримидиновых оснований. В клетках молликут имеются ферменты синтеза нуклеотидов с использованием готовых азотистых оснований в качестве субстратов. Поэтому для нормального роста молликутам необходимо присутствие во внешней среде, по меньшей мере, одного пиримидинового нуклеозида и двух пуриновых оснований [3]. Нуклеозиды, имеющиеся в питательной среде, сначала преобразуется в соответствующие азотистые основания и затем используются для синтеза нуклеотидов. Для синтеза пиримидиновых нуклеотидов в клетках молликут необходимым и достаточным является наличие в питательной среде цитидина. Цитидин - нуклеозид, который может быть преобразован в уридин с помощью имеющегося у молликут фермента цитидиндэаминазы. Синтез пиридиновых нуклеотидов в молликутах осуществляется за счет фосфорилирующих ферментов уридин-, тимидилат- и цитидилат-киназы. Пуриновые мононуклеотиды синтезируются в молликутах путем переноса группы фосфорибозила к соответствующему основанию с помощью фермента фосфорибозилтрансферазы Например, реакция [2] .

преобразования аденина в AMP в клетках молликут катализируется ферментом аденин-фосфорибозилтрансферазой. Фосфорибозилпирофосфат синтезируется в клетке с помощью реакций пентозофосфатного пути. Преобразование пуринмонофосфатов в трифосфаты осуществляется ферментами аденилат- или гуанилат-киназой [21] .

Молликуты также не способны синтезировать аминокислоты и в основном получают их извне благодаря действию специальных ферментов - пермеаз .

Исключением являются бактерии вида A. laidlawii, в геноме которых, в отличие от остальных молликут, аннотированы ферменты частичного биосинтеза аминокислот фенилаланина и тирозина из фосфоенолпирувата [23]. Также в клетках ахолеплазм имеется несколько ферментов, участвующих в биосинтезе такой аминокислоты как триптофан. В свою очередь, ферменты метаболизма аминокислот представлены во всех видах молликут .

Геному микоплазм свойственен минимальный набор генов синтеза АТФ, необходимый для жизнедеятельности и паразитирования клеток. Практически все молликуты лишены эффективной дыхательной системы. В их протеоме отсутствуют цитохромы, что исключает механизм генерации АТФ с помощью окислительного фосфорилирования [2, 31, 32]. Таким образом, метаболические пути молликут энергетически не производительны и сопряжены с постоянным импортом необходимых соединений для протекания внутриклеточных реакций из окружающей среды и в некоторых случаях приводят к истощению ткани хозяина по специфическим субстратам .

На основе способности молликут к метаболизму углеводов, их делят на ферментирующие и неферментирующие. В зависимости от типа молликут пируват, генерирующийся в процессе гликолиза в клетках, может быть переработан до лактата лактатдегидрогеназой в клетках ферментирующих молликут или до ацетил-КоА по пируватдегидрогеназному пути в клетках неферментирующих молликут [33, 34]. Некоторые микоплазмы, такие как M .

agalactiae, M. genitalium, и M. bovis, способны окислять органические кислоты (лактат, пируват) с образованием уксусной кислоты и СО2 [31, 35]. Гены такого метаболизма пирувата были определены в некоторых микоплазмах, например, М .

capricolum [36] и M. genitalium [34]. Члены ферментирующей группы молликут вырабатывают молочную кислоту (лактат) в процессе усвоения углеводов и снижают рН в среде культивирования в процессе роста. Определение нуклеотидных последовательностей генома и их аннотация показали, что S .

melliferum, M. gallisepticum и A. laidlawii относятся к ферментирующему типу и имеют все ферменты гликолиза - главного пути метаболизма глюкозы .

Важной особенностью углеводного метаболизма молликут является неполная представленность ферментов пентозофосфатного пути - в аннотации генома молликут отсутствует один из двух основных ферментов - трансальдолаза .

Способом выработки АТФ в условиях недостатка источников энергии в клетках молликут является путь дезаминирования аргинина. Большинство неферментирующих молликут и некоторые ферментирующие виды имеют гены ферментов пути дезаминирования аргинина (орнитиновый цикл). Это путь гидролиза аминокислоты аргинина, протекающий с образованием орнитина, АТФ, CO2 и аммиака, повышающего значение pH бактерии [2]. В цикле используются три фермента: аргинин-деаминаза, орнитин-карбамоил-трансфераза, и карбаматкиназа Деградация аргинина соединена с эквимолярным [37] .

производством АТФ и субстратным фосфорилированием. Орнитиновый цикл найден в разнообразных филогенетических бактериальных группах, например, Pseudomonas, Bacillus, и молочнокислых бактериях [37]. Роль этого пути в качестве единственного источника ATФ у неферментирующих молликут продемонстрирована только для некоторых видов [2, 33, 38]. Некоторые виды, например M. hominis, M. arthritidis, M. gallinarum, используют орнитиновый цикл в качестве альтернативного способа выработки энергии и благодаря этому способны выживать в условиях отсутствия углеводов в среде [39] .

Еще один потенциальный механизм производства энергии в клетках молликут основан на получении АТФ из ацетилфосфата и AДФ с помощью ацетаткиназы, в сочетании с образованием ацетилфосфата из ацетил-коэнзима А под действием ацетил-фосфат-трансферазы. Оба фермента встречаются как у ферментирующих, так и у неферментирующих молликут. А ацетил-коэнзим А может быть получен в микоплазмах путем окислительного фосфорилирования пирувата [2] .

У многих видов молликут в процессе формирования специфичности к организму-хозяину появились индивидуальные пути поизводства АТФ .

Например, уникальный энергетический обмен уреаплазм, представляющий собой особый результат адаптации этих бактерий к среде обитания - слизистым половых органов и мочевым путям человека. Для выживания и деления клеткам уреаплазм необходимо наличие мочевины в среде [2]. В геноме этих организмов не было обнаружено ферментов, ответственных за реакции гликолиза, орнитинового цикла или ацетат-киназного АТФ-генерирующего путей .

Экспериментально показано, что синтез АТФ в клетках уреаплазм происходит при генерации трансмембранного потенциала за счет действия фермента АТФ-азы типа FOF1 [40]. При значении рН внешней среды 6,0 (оптимальный рН уреаплазменного роста) в процессе гидролиза мочевины генерируется химический потенциал аммиака и, одновременно, увеличивается протонный электрохимический потенциал, что запускает процесс синтеза АТФ [41] .

Благодаря паразитическому образу жизни геном молликут значительно редуцирован. Однако кажущиеся ферментативные пробелы в метаболических путях являются заполненными за счет универсальности ферментов .

Многофункциональные ферменты представляют собой одно из решений для экономии генетической информации в организмах с минимальными геномами. В протеогеномных аннотациях молликут можно обнаружить множество неполных метаболических путей или ферментативных «пробелов» в метаболических путях .

Кроме того, часто аннотированные гены не транскрибируются, поэтому было бы ошибочно в описании метаболизма этих бактерий опираться только на результаты аннотирования генома. Отсутствие корреляции между данными аннотации и результатами метаболомных экспериментов также можно объяснить ошибочным определением функции гена или посттрансляционной модификацией, инактивирующей транслируемый белок. Например, в клетках М. genitalium и многих других молликут обнаружена малатдегидрогеназая активность, однако, рамок считывания этого белка в геноме M. genitalium и M. pneumoniae не было обнаружено [34, 42]. Оказалось, что продукт гена отнесен к лактатдегидрогеназе в М. и М. но выполняет также функции genitalium hyopneumoniae, малатдегидрогеназы [43]. Накопленные данные о наличии и отсутствии у молликут систем ферментативной регуляции наряду со способностью клеток быстро адаптироваться к различным условиям роста делают их удобными модельными объектами для изучения принципов организации минимальной живой системы на метаболическом уровне .

2.2 Реконструкции карт метаболизма исследуемых организмов

Важным этапом системного анализа микроорганизма является реконструкция его метаболической карты, то есть сбор и визуализация всех потенциальных биохимических процессов клетки. Процесс моделирования метаболических карт может приводить к важным результатам уже на этапе разработки. Например, в работе группы Л. Серрано при реконструкции метаболической карты M. pneumoniae наблюдались несоответствия между моделью, составленной согласно аннотации генома, и экспериментальными результатами, полученными ранее. Такие несоответствия были разрешены с помощью сопоставления последовательности аминокислот ферментов, анализа литературы и уточнения полученной модели [16]. В работе автора было экспериментально показано, что нуклеозид цитидин является необходимым и достаточным компонентом питательной среды, для того, чтобы синтезировать все пиримидиновые нуклеотиды в клетке (ЦТФ, УТФ, ТТФ) [3]. Данные о метаболизме других видов микоплазм и первоначальные расчеты предполагали, что урацил может также служить предшественником для синтеза всех пиримидиновых нуклеотидов за счет реакции перехода УТФ в ЦТФ, катализируемой ЦТФ-синтазой [44]. Проведенные эксперименты показали, что наличие урацила в качестве единственного пиримидинового нуклеозида в питательной среде является не достаточным для культивирования молликут [3] .

Поиск в геноме M. pneumoniae гена, кодирующего гомолог фермента ЦТФсинтазы в других микоплазмах, в E. coli и Lactococcus lactis, не дал никаких результатов. Тогда с помощью проведения реконструкции метаболизма, авторам удалось определить, что пиримидиновый метаболизм M. pneumoniae уникально отличается от других микоплазм отсутствием реакции перехода УТФ в ЦТФ, катализируемой ЦТФ-синтазой, и что цитидин является необходимым субстратом для культивирования этого организма [16] .

Кроме возможности получить важные сведения о метаболизме организма на этапе разработки схемы метаболизма, реконструкция служит для сортировки отдельных белков в группы (относящиеся к одному метаболическому пути или белковому комплексу) и позволяет улучшить функциональную аннотацию генов [45]. Кроме того, реконструкция метаболизма обеспечивает платформу для визуализации и анализа любых «омиксных» данных .

Существует два основных подхода к реконструкции карт метаболизма. Один из двух основных алгоритмов реконструкции направлен на составление схемы метаболизма исходя из первоначальных данных аннотирования генома и последующее уточнение наличия ферментативных реакций. Второй алгоритм, который наиболее часто используются исследователями, состоит из первоначального уточнения функций ферментов и последующей реконструкции метаболических путей .

Наиболее информативным является первый алгоритм, заключающийся в построении схемы на основе первичной аннотации, так как он включает все возможные реакции, катализируемые ферментами [45]. Такой алгоритм состоит из следующих шагов: 1) создание метаболической схемы на основе автоматической аннотации; 2) проверка назначенных согласно аннотации реакций, включающая поиск ферментативных «пробелов» в метаболических путях; поиск аннотированных ферментов, способных катализировать реакции, соответствующие «пробелам» в схеме; проверку возможности утилизации или выведения всех конечных продуктов; описание транспортной системы, ответственной за импорт необходимых субстратов .

Начальный этап построения единой схемы метаболических реакций в первом алгоритме реконструкций проводится на основании аннотации генов организма. Почти все доступные последовательности генома в настоящее время систематически обработаны с помощью автоматизированных программ, которые идентифицируют кодирующие последовательности и функционально аннотируют гены. Исходя из данных функциональной аннотации генов, предполагаемым ферментам присваивают соответствующие катализируемые ими реакции .

Интернет ресурсы, содержащие различные варианты биохимических данных, способствуют упрощению процедуры первичной реконструкции метаболизма .

Существует два типа баз данных, (БД) содержащих необходимую информацию .

Первый тип - фермент - ориентированные БД, которые предоставляют информацию о функциях ферментов, например BRENDA [46], SwissProt [47]. С помощью информации, предоставленной такими базами выявляются данные о дополнительных активностях аннотированных ферментов и их способности катализировать различные биохимические превращения в метаболическом пути .

Другой тип БД - базы метаболических путей, содержащие описание биохимии метаболических процессов, например описывающая метаболизм EcoCyc, кишечной палочки [48] или UM-BDD база данных, описывающая пути катаболизма у разных видов бактерий [49]. Такие базы данных позволяют выяснить все биохимические реакции, в которых участвует тот или иной метаболит и определить взаимосвязь между реакциями. Реконструкцию схемы метаболизма также можно проводить, используя уже имеющиеся реконструкции родственных организмов. Часто реакции группируются в метаболические пути или модули, которые сохраняются в нескольких организмах. Однако, несмотря на секвенирование и аннотацию геномов многочисленных микроорганизмов, функции многих генов остаются неизвестными и, наоборот, многие преобразования катализируются неизвестными ферментами. Кроме того, не всегда идентифицируются гены, соответствующие экспериментально охарактеризованным ферментам. Все это представляет собой значительное препятствие для создания точных моделей метаболизма, основанных на данных протеогеномной аннотации .

Второй этап реконструкции, заключающийся в уточнении полученной первичной реконструкции, является наиболее трудоемким. Существуют несколько минимальных требований к детализации, необходимой для реконструкции полной модели метаболизма бактерий .

Во-первых, метаболические пути должны быть представлены в соответствии с особенностями физиологии исследуемого организма. Например, первоначальная реконструкция метаболизма Lactobaccillus plantarum предполагала, что сукцинил-КоА является субстратом для биосинтеза метионина в реакции, катализируемой сукцинилтрансферазой [50]. Экспериментально было показано, что клетки L. рlantarum способны синтезировать метионин. Однако сукцинил-КоА не может быть синтезирован в клетках этого организма из-за неполной представленности ферментов цикла Кребса (цикла биохимических реакций, в процессе которых образуются основные предшественники биосинтеза) .

Это указывало на наличие противоречия между экспериментальными данными и данными первичной реконструкции, проведенной для этого организма при проведении аннотации генома. Анализ субстратной специфичности фермента сукцинилтрансферазы и его ортологов у других организмов показал, что ацетилКоА может также выступать в роли субстрата для синтеза метионина [50]. Клетки L. рlantarum способны синтезировать ацетил-КоА. Выявление подобных несоответствий, которые могут быть идентифицированы во всей метаболической сети, требует хороших знаний физиологии микроорганизма .

Во-вторых, основные пути метаболизма должны быть ферментативно завершенными. При отсутствии аннотированного фермента в метаболическом пути постулируют соответствующую активность в клетке, которая в ходе дальнейшего анализа будет подтверждена или опровергнута. Для поиска такого гена используют филогенетический анализ ферментов, анализ слияния и порядка генов в кодирующих рамках, и экспериментальные данные протеомного и транскриптомного исследований. Однако существует глобальная проблема, требующая решения перед проведением заполнения метаболических пробелов в путях: не всегда ясно, должна ли быть назначена ферментативная активность в клетке, или же метаболические реакции протекают по обходному пути. Для решения такого вопроса исследователи обращаются к данным о механизмах протекания реакций в близкородственных организмах и о физиологии исследуемого организма. Наиболее надежными данными, из которых можно сделать вывод о возможности протекания того или иного превращения в клетке, являются экспериментальные доказательства соответствующей биохимической активности. Получить информацию о синтезируемых в ходе реакции соединениях можно в ходе проведения метаболомного исследования. [51] .

В дополнение к полученной уточненной модели, в схеме должны быть определены обратимость и локализация реакций. Некоторые метаболические или ферментативные базы данных предоставляют информацию о типе реакций (UniPathway, KEGG, EcoСyc). Если информация о типе реакции не доступна, то на основании данных об энергии Гиббса, а также исходя из наличия энергетических эквивалентов (НАДH или АТФ), включенных в реакции, можно предположить обратимость реакции [52, 53] .

В метаболические модели должна быть включена информация о локализации метаболитов в клетке и отсутствии прямого взаимодействия некоторых ферментов и метаболитов. Важно разделить в схеме такие части бактериальной клетки, как периплазма и цитоплазма. Необходимо учитывать, что ферменты, присутствующие в одной части клетки не могут взаимодействовать с метаболитами, присутствующими в другой .

Для построения точной метаболической модели необходимо также учитывать клеточные системы транспорта метаболитов. Транспорт метаболитов может быть описан с помощью инструментов сравнительной геномики, которые идентифицируют транспортные ферменты на основании данных о транспортных системах микроорганизмов (например, TransportD) [54]. Тем не менее, методы автоматического аннотирования вряд ли способны определить наличие специфических белков-переносчиков в клетке. Данные о переносимых через мембрану метаболитах часто получают, используя информацию о физиологии микроорганизма и способности потреблять питательные субстраты .

Реконструкция метаболизма обеспечивает платформу для визуализации и анализа метаболомных данных. Однако даже с использованием результатов метаболомного анализа и данных протеогеномной аннотации реконструкция всего метаболизма микроорганизма представляет собой трудоемкую задачу, так как требуется обработка большого объема данных. Поэтому большинство существующих метаболических моделей были реконструированы для детально изученных организмов. Например, наиболее полная последняя модель метаболизма кишечной палочки - «iAF1260» - включила в себя данные более чем других источников В нашей работе был выбран наиболее 320 [55] .

информативный алгоритм реконструкции, заключающийся в построении схемы на основе первичной аннотации и последующем уточнении ферментативных реакций. Полученная реконструкция позволяет составить списки возможных внутриклеточных метаболитов для обработки результатов анализа метаболома и визуализировать результаты метаболомного анализа для выявления механизмов регуляции в клетке .

2.3 Основные методы, используемые для анализа метаболитов бактерий

В конце 40-х годов прошлого века Роджер Вильямс в своих исследованиях предположил наличие метаболического профиля, который мог бы отражать состав биологических жидкостей. Свои исследования биологических жидкостей (моча и слюна человека) профессор Вильямс проводил с использованием тонкослойной хроматографии [56]. Однако, только в 60-х и 70-х годах прошлого столетия технологический прорыв в методах анализа метаболитов позволил осуществить их количественное измерение .

В 1971 году с помощью метода газовой хромато-масс-спектрометрии в работе профессора Хорнинга был выявлен широкий спектр соединений в образцах мочи и тканей человека, который был объединен под общим термином «метаболический профиль» [57]. Позже, в середине 70-х годов прошлого столетия Группа Хорнинга совместно с такими учеными, как Лайнус Полинг и Артур Робинсон, внесла существенный вклад в разработку методов мониторинга метаболитов с помощью газовой хроматографии совмещенной с масс-спектрометрией. А уже в конце 80-х годов наряду с массспектрометрией для идентификации метаболитов стали применять метод ЯМРспектроскопии. Такие исследования в основном проводились в лаборатории Джереми Николсона в колледже Биркбек при Лондонском университете и позже в Лондонском королевском колледже [56]. Однако термин «метаболом» впервые появился в литературе только в 1998 году в работе Хелен Твидл, посвященной анализу метаболитов в клетках бактерий E.coli. В этой работе было дано определение «метаболома», как общего метаболического состава клетки, меняющегося в различных условиях роста [58]. С этого момента в литературе начинают появляться исследования метаболома, посвященные изучению принципов биохимической организации микроорганизмов .

Одними из первых организмов, для которых проводились подобные исследования, были бактерии E.coli и дрожжи S. cerevisiae [59-62]. Выбор именно этих организмов в качестве объекта метаболомных исследований связан с возможностью их культивирования на искусственной среде и наличием, на тот момент, большого количества накопленных данных о метаболизме этих организмов, их генетике и физиологии, что облегчало интерпретацию полученных результатов. В первых исследованиях, посвященных анализу метаболома в клетках микроорганизмов, рассматривались лишь отдельные группы метаболитов, а для их анализа чаще всего использовались методы тонкослойной и жидкостной хроматографии, совмещенной с УФ-детектированием. Такие методы позволяли исследовать только наиболее высокопредставленные компоненты метаболома клетки, принадлежащие к одному классу веществ. Развитие системной биологии привело к появлению интереса научного сообщества к исследованиям всего набора метаболитов в образце в различных условиях роста и, следовательно, к поиску методов анализа метаболома, позволяющих решить такую задачу. В состав метаболома каждого микроорганизма входят от 100 до нескольких тысяч компонентов, имеющих различные физико-химические свойства и представленных в широком диапазоне концентраций. Провести анализ всего набора метаболитов в образце одним единственным методом практически невозможно, однако максимально приближенный к этой цели результат удалось получить с использованием методов жидкостной и газовой хроматографии, совмещенных с масс-спектрометрическим детектированием. Использование этих методов позволяют охарактеризовать и количественно измерить около 30 % всех компонентов метаболома клеток. Так, в 2010 году группе под руководством профессора Л. Вилмитзера удалось идентифицировать 247 метаболитов в клетках бактерии E.coli и количественно измерить из них - 170 метаболитов [63]. В настоящее время в метаболомике сформировалось новое направление исследований под названием «флаксомика», связанное с измерением потоков метаболитов и их изменений при внешних воздействиях. Флаксомика - это область исследований, направленная на измерение динамики потоков и концентраций метаболитов во времени. Для проведения анализа потоков метаболитов были разработаны методы мгновенного добавления С13-меченых углеводов в питательную среду микроорганизмов и последующего детектирования С13- производных в метаболоме клеток .

Традиционно, в метаболомике используются такие этапы анализа, как культивирование клеток, остановка метаболической активности клетки, выделение метаболитов, разделение метаболитов и детектирование сигнала, обработка результатов и интерпретация данных. В связи с тем, что метаболом является чрезвычайно динамической системой, одним из самых важных этапов анализа метаболома является этап пробоподготовки образца, включающий культивирование клеток, остановку метаболической активности клетки и выделение метаболитов. Важно, чтобы активный процесс жизнедеятельности клетки был мгновенно остановлен на ферментативном уровне с минимальными потерями по образовавшимся веществам перед проведением исследования. От качества проведения этого этапа зависит адекватность полученных результатов .

2.3.1 Тушение метаболизма и экстракция метаболитов

Поскольку уровень метаболитов в клетках микроорганизмов может изменяться в течение нескольких минут, особое внимание уделяют стадиям пробоподготовки клеток. Для исследований воздействия различных факторов на внутриклеточные метаболиты бактерий важно проводить анализ в таком состоянии клеток, при котором естественные флуктуации концентраций метаболитов будут минимальными [64]. Так в 2009 году для бактерий E.coli были проведены исследования изменения содержания метаболитов в течении различных фаз роста клеток [65]. В работе профессора Ж. Шимански было показано, что оптимальным состоянием клеток для проведения анализа изменений метаболома являются ранняя и средняя логарифмические фазы роста, в которых наблюдается активный рост клеток при относительно постоянном составе метаболома. При переходе в стационарную фазу роста бактерий наблюдаются значительные естественные флуктуации концентраций метаболитов, которые могут быть ошибочно интерпретированы как существенные, связанные с влиянием внешнего воздействия на клетки [65]. После этапа культивирования клеток проводят процедуру остановки ферментативной активности, которая позволяет получить метаболический профиль организма в строго определенном состоянии .

Тушением метаболической активности называют процедуру остановки биохимических реакций в клетке в течение короткого промежутка времени [62].

К процедуре подавления метаболической активности клетки предъявляют определенные требования:

- процедура подавления метаболической активности должна максимально быстро останавливать клеточную ферментативную активность;

- во время проведения процедуры не должно происходить повреждения мембраны клетки, поскольку это может привести к потере внутриклеточных метаболитов .

С момента появления первых исследований метаболома в конце 90-х годов и по сегодняшний день ведется постоянная разработка новых методов проведения подавления метаболической активности клетки. Тушение метаболизма может проводиться снижением температуры образца с помощью обработки жидким азотом (T - 70°C). Такой метод тушения метаболизма является наиболее простым в использовании, однако сопряжен с повреждением мембраны клетки кристаллами льда и частичной потерей метаболитов. Чаще всего для поведения остановки метаболической активности клеток используют охлажденные растворы метанола и этанола, с добавлением вспомогательных веществ. Например, для анализа метаболитов с высокой массой ( 300 Да) в клетках L. plantarum, S .

cerevisiae описаны подходы с использованием охлажденного до -70 °С шестидесятипроцентного раствора метанола в воде с добавлением 70 мМ HEPES для поддержания pH [66]. Другой пример протокола тушения активности - метод обработки охлажденной смесью метанола с глицерином при анализе внутриклеточных аденилатов бактерий E. coli [67]. Однако эффективность этого метода для других соединений не была продемонстрирована. Также существуют методы остановки клеточной активности с использованием смеси охлажденного этанола и хлорида натрия, который эффективен для анализа широкого спектра метаболитов различных видов бактерий [66]. Недостатком этого метода является возможное наличие остаточной ферментативной активности. Несмотря на постоянное появление новых способов подавления клеточной активности, наиболее эффективным и универсальным методом для различных видов бактерий является метод на основе обработки охлажденным раствором метанола, разработанный в 1992 году профессором В. Конингом [68]. Кроме описанных реагентов, для последующего количественного измерения метаболитов во время тушения метаболизма в смесь добавляют внутренние стандарты таким образом, чтобы стандарты имели такие же шансы на деградацию во время поведения дальнейшей пробоподготовки и анализа, что и исследуемые эндогенные соединения [69] .

Для осуществления процедуры тушения метаболической активности могут быть использованы два подхода. Многие исследователи выбирают способ обработки клеток с применением фильтра. Такой метод включает этапы фильтрования клеток от питательной среды и промывку клеток на фильтре, совмещенные с мгновенным охлаждением клеток с помощью жидкого азота и с последующей экстракцией метаболитов [70, 71]. Такой метод применим только для микроорганизмов, способных задерживаться на фильтре. Достоинствами этого способа являются простота в использовании, быстрота проведения процедуры обработки клеток и хорошая воспроизводимость. Недостатками метода является возможность его применения только для бактерий, культивируемых в жидкой среде и имеющих размеры и свойства клетки подходящие для обработки на фильтре. Другой подход к проведению тушения метаболизма - «метод ввода», состоящий из ввода полученного образца непосредственно в раствор охлажденного метанола (или другого выбранного агента), центрифугирования и дальнейшей экстракции метаболитов из полученного осадка клеток. Такой метод может включать потери метаболитов (в основном в грамотрицательных бактериях) в результате частичного повреждения мембраны во время обработки клеток органическими растворителями и обычно используется для таких организмов, как например S. сerevisiae [68, 72, 73]. Клетки животных тканей отличаются от клеток бактерий не только отсутствием клеточной стенки, но и наличием дополнительных контактов между клетками, как и растительные клетки тканей. Поэтому при анализе метаболома животных и растительных тканей для остановки метаболической активности используют охлаждение с помощью жидкого азота с последующей процедурой механического разрушения клеток [74]. После быстрого подавления метаболизма и этапа промывки, клетки отделяют от среды и подвергают процедуре экстракции метаболитов .

Экстракция метаболитов - это метод извлечения эндогенных метаболитов из клеток. Метод экстракции метаболитов выбирают исходя из структурнофункциональных особенностей исследуемого объекта: устойчивости мембраны (или наличия клеточной стенки) клетки, химических свойств исследуемых соединений и активности ферментов. При выборе того или иного протокола проведения этого этапа обработки следует помнить, что при проведении процедуры экстракции метаболитов должно извлекаться максимально возможное количество соединений не подвергаясь модификации, а получившийся образец должен быть совместимым с выбранным методом анализа .

Как и в случае процедуры тушения метаболической активности, для проведения экстракции метаболитов разработано множество методов. Для экстракции метаболитов чаще всего используют охлажденные органические растворители: ацетонитрил, метанол, этанол, смесь спиртов с водой в различных соотношениях, а также хлороформ [75]. Существуют методы экстракции метаболитов путем значительного изменения рН в образце. Для обработки используют высокие концентрации щелочи (например КОН или NaOH), или концентрации кислоты (например, хлорной кислоты, соляной кислоты или трихлоруксусной кислоты), однако обработка клеток сильными кислотами и щелочами может быть сопряжена с химическим изменением исследуемых метаболитов. Также используют обработку горячим этанолом или метанолом, перхлоратом или смесью метанол/хлороформ. Для извлечения метаболитов из клеток, кроме обработки специальным реагентом применяют дополнительную процедуру последовательного замораживания и размораживания клеток. При исследовании грамотрицательных бактерий, характеризующиеся наличием двух мембран, используют дополнительное ультразвуковое воздействие [67] .

Несмотря на разнообразие методов проведения процедуры экстракции метаболитов и необходимость выбирать протокол с учетом свойств исследуемого образца, существует универсальный протокол, который подходит для экстракции метаболитов из всех видов бактериальных клеток. Такой протокол был разработан в 2003 году профессором Р. Махарджаном и является одним из самых популярных на сегодняшний день методов выделения метаболома из бактериальных клеток [19]. Метод включает обработку клеток охлажденным раствором 60%-80% метанола (-40°С) в воде и последующую процедуру замораживания и размораживания образца [59]. Этот метод сочетает в себе экстракцию метаболитов из лизированных клеток с одновременным подавлением метаболической активности за счет действия охлажденного метанола. Кроме того, этот метод демонстрирует превосходные результаты в покрытии метаболома, воспроизводимости результатов и простоте использования. Метод обработки охлажденным метанолом может быть использован также для выделения метаболитов из образцов биологических жидкостей (моча, сыворотка, плазма и др.) [59, 76]. Для процедуры выделения метаболитов из клеток эукариот (в частности S. cerevisiae) лучшими признаны методы с использованием кипящего этанола и смеси хлороформ-метанол [77] .

Перечисленные методы экстракции применяются для анализа всего метаболома, что является основной задачей метаболомики; однако необходимо отметить, что для анализа определенных метаболитов такие методы не всегда эффективны. Поэтому, если в процессе проведения исследований метаболома возникают задачи анализа отдельных неустойчивых метаболитов, подбирают наиболее подходящий способ обработки клеток. Особенно это касается анализа коферментов, находящихся в клетке в виде окисленных и восстановленных форм .

Восстановленные формы кофакторов (НАДН, НАДФН) являются неустойчивыми соединениями и в процессе пробоподготовки подвергаются окислению. В некоторых публикациях описаны подходы для выделения коферментов в неизмененной форме изолированно от остальных метаболитов. Например, при использовании в качестве экстрагента смеси вода:ацетонитрил:метанол с добавлением муравьиной кислоты, эффективно сохраняется отношение количественной представленности окисленной и восстановленной формы коферментов производных аденина (НАД и НАДН). Недавно был разработан метод количественного исследования содержания НАДФ и НАДФН в метаболоме Pichia pastoris с помощью экстрагирования в аммонийно-ацетатном буфере при pH 8 и нагревании образца до 85°С [78]. Однако методы, которые полностью сохраняют восстановленные формы коферментов в неизмененном состоянии наряду с остальными метаболитами и позволяют провести их совместный метаболомный анализ, все еще не разработаны .

При работе с молликутами используют метод тушения, совмещенный с выделением метаболитов в предварительно промытых клетках с последующим центрифугированием [3]. Совмещенный протокол используется в связи с особенностью строения клеток бактерий, принадлежащих к классу молликут. Эта особенность заключается в отсутствии клеточной стенки. Клетки молликут способны деформироваться и проходить сквозь поры фильтра. Кроме того, отсутствие клеточной стенки приводит к мгновенному повреждению мембраны метанолом или другими агентами, которые обычно используют для тушения метаболизма .

После проведения экстракции органические растворители обычно удаляют путем испарения в вакууме. Осадок ресуспендируют в маленьком объеме воды, центрифугируют и надосадочную жидкость сохраняют при низких температурах до анализа соответствующим аналитическим методом на срок не более месяца .

Процедура удаления растворителя может также быть связана с риском изменения метаболома. Однако эта стадия обработки позволяет увеличить соотношение сигнал-шум в полученных спектрах и удалить растворители, которые могут ухудшить разделение с помощью хроматографии на обращенной фазе. Такая процедура позволяет анализировать гидрофильные соединения. Для анализа гидрофобных метаболитов используют другие методы экстракции и растворения .

После получения смеси метаболитов, необходимо провести разделение и детектирование компонентов метаболома .

–  –  –

Следующим этапом анализа является разделение полученной смеси метаболитов. В настоящее время доступно несколько методов разделения метаболитов. Разделение метаболитов проводят с помощью капиллярного электрофореза [79, 80], газовой хроматографии [75, 81, 82] или жидкостной хроматографии [83-85], включая ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и УВЭЖХ (ультра-высокоэффективная жидкостная хроматография) [86-89] .

–  –  –

Газовая хроматография это метод фракционирования летучих компонентов смеси, при перераспределении их между подвижной фазой, представленной инертным газом (газ-носитель), и неподвижной фазой, закрепленной на колонке [1]. Газовая хроматография является методом эффективного разделения метаболитов и позволяет проводить высоко воспроизводимые измерения. Этот метод позволяет провести анализ как летучих, так и нелетучих соединений. Последние приобретают летучие свойства посредством процедуры предварительной дериватизации - процесса химического превращения исходного соединения с целью придания ему определенных аналитических свойств, например, летучести или термической устойчивости. В газовой хроматографии используются высокие температуры для перевода жидкой смеси в газообразное состояние, поэтому анализируемые вещества (аналиты) должны обладать также и термической устойчивостью. В состав метаболитов входят соединения, обладающие сильнополярными гидроксильными, амино-, амидо-, фосфо- и тиольными функциональными группами. Анализ таких соединений с помощью газовой хроматографии затруднен из-за отсутствия у них требуемых физико-химических свойств. Обычно перед анализом полярных метаболитов для увеличения их термической стабильности и летучести химически модифицируют заряженные функциональные группы. Например, тиольные, аминогидроксильные и карбоксильные группы могут быть дериватизированы путем алкилирования, ацилирования или силилирования. [90, 91]. Таким образом, разделение методом газовой хроматографии может быть применено для анализа практически всех классов соединений. Однако необходимость дериватизации образца усложняет этап пробоподготовки образца для поведения разделения метаболитов с помощью газовой хроматографии [92] .

–  –  –

Кроме газовой хроматографии для разделения метаболитов используется метод капиллярного электрофореза (КЭ). Разделение метаболитов с помощью метода КЭ основано на физико-химических различиях в размерах и зарядах молекул. Основным преимуществом метода КЭ, в отличие от методов хроматографического разделения, является возможность одновременной регистрации катионов и анионов в малом объеме пробы (объем необходимого образца до 30 нл) [93]. Основной недостаток этого метода заключается в сложности совмещения капиллярного электрофореза с последующей массспектрометрической детекцией из-за отсутствия потока переносящей жидкости .

Кроме того, по сравнению с методом хроматографического разделения капиллярный электрофорез имеет существенно меньшую разрешающую способность. Метод капиллярного электрофореза может быть применен для анализа метаболома, однако, в настоящее время, в связи с основными недостатками метода данный подход не получил широкого распространения в метаболомных исследованиях [94-96] .

2.3.2.3 Жидкостная хроматография

Одним из наиболее эффективных способов разделения смеси метаболитов является метод жидкостной хроматографии. Жидкостная хроматография (ЖХ) это способ разделения веществ, основанный на распределении компонентов смеси между подвижной (жидкой) и неподвижной (твердой) фазами [1]. Подвижной фазой в ЖХ является жидкость, называемая элюентом, а неподвижная фаза представляет собой твердый сорбент, наполняющий колонку. Разделение метаболитов в методе ЖХ основано на различии в таких физико-химических свойствах соединений, как заряд молекулы, гидрофобность, разветвленность углеродной цепи, размер молекулы, химические свойства характеристических групп, входящих в состав молекулы и др. Преимуществами, которые приводят к все более широкому использованию метода разделения с помощью жидкостной хроматографии, являются: отсутствие сложных процедур пробоподготовки образца, высокая воспроизводимость, возможность одновременного количественного определения множества метаболитов, небольшие объемы анализируемых проб (около 1 мкл) и низкие концентрационные пределы обнаружения в диапазоне от пико- до фемтомолей [97, 98]. В дополнение, метод жидкостной хроматографии совместим с масс-спектрометрическими детекторами .

При анализе метаболитов с помощью метода масс-спектрометрии высокое содержание примесей в образцах, выделенных из культуры, затрудняет дальнейшее детектирование ионов, так как примеси в пробах загрязняют элементы ионной оптики масс-спектрометра и являются причиной снижения эффективности ионизации анализируемых соединений. Такое явление получило название ионной супрессии [99, 100]. Предварительное фракционирование веществ с помощью жидкостной хроматографии позволяет снизить ионную супрессию за счет отделения большинства примесей. В связи с перечисленными достоинствами метода, жидкостная хроматография наиболее часто используется исследователями для разделения метаболитов .

В настоящее время разделение веществ с помощью жидкостной хроматографии выполняется с использованием таких вариантов метода, как высокоэффективная и ультравыскокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC и UPLC). Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - это вариант проведения разделения смеси по методу жидкостной хроматографии, отличающийся применением высокого давления при подаче элюента (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3-5 мкм) [101]. Метод ВЭЖХ позволяет улучшить характеристики разделения веществ по сравнению с ЖХ разделением и повысить скорость проведения анализа (среднее время анализа от 3 до 60 мин) .

Ультравыско-эффективная жидкостная хроматография (УВЭЖХ) - это метод хроматографического разделения веществ, в котором используются частицы сорбента с размером менее 2 мкм [102]. Такой подход позволяет добиться максимального разделения компонентов в смеси, однако к недостаткам данного подхода можно отнести существенное увеличение давления (от 500 бар до 1200 бар), необходимого для обеспечения потока растворителя через УВЭЖХ сорбенты .

Для разделения смеси метаболитов могут быть использованы несколько режимов высокоэффективной жидкостной хроматографии: катионно- и анионнообменная, обращено-фазовая и нормально-фазовая хроматография, так называемый, метод гидрофильной хроматографии (жидкостная хроматография на основе гидрофильного взаимодействия (HILIC)) и ион-парная хроматография .

Каждый из методов дает преимущество в разделении определенной группы соединений. Выбор метода хроматографического разделения и условий анализа должен основываться на природе тех метаболитов, которые представляют наибольший интерес в пробе (важно учитывать такие свойства, как гидрофобность, заряд, растворимость и полярность анализируемых веществ) [103] .

Метод ионообменной хроматографии основан на замещении ионов, содержащихся на сорбенте ионами анализируемого вещества. Сорбенты представляют собой органические смолы, содержащие ионогенные группы, способные к диссоциации и обмену ионами с анализируемым раствором .

Подвижной фазой при разделении положительно заряженных ионов на катионитных сорбентах служат растворы кислот, а при разделении отрицательно заряженных ионов на анионитных смолах - растворы щелочей. Кроме кислоты или основания в состав элюента может входить нейтральный электролит, например NaNO3, ионы которого конкурируют с разделяемыми ионами за взаимодействие с сорбентом. При этом с помощью изменения концентрации электролита в растворителе можно влиять на удерживание ионов на сорбенте .

Удерживание однозарядных ионов падает пропорционально концентрации соли в элюенте, двухзарядных ионов - пропорционально квадрату концентрации соли .

Ионообменная хроматография обычно не используется совместно с массспектрометрическим анализом метаболитов в связи с возможностью возникновения явления ионной супрессии ионами солей, которые используются в этом методе [104-106] .

Обращенно-фазовая хроматография (ОФХ) - это метод жидкостной хроматографии, в котором используют сорбенты, содержащие неполярные, как правило, длинные алкильные группы (С18, С8, С3), и полярные растворители (например, водно-метанольные, водно-ацетонитрильные смеси). В методе ОФХ анализируемые вещества удерживаются на поверхности сорбента за счет размеров их молекул, дипольного момента, поляризуемости и гидрофобных свойств неполярной части молекулы [107]. В этом методе сорбция компонентов смеси происходит за счет сильного взаимного притяжения полярных молекул растворителя и вытеснения менее полярных молекул анализируемой смеси из полярной среды. При использовании метода ОФХ поверхность неподвижной фазы связывает вытесненные молекулы аналитов, ориентированные к ней гидрофобной частью и удерживает их слабыми дисперсионными силами .

Применение обращено-фазовой хроматографии в качестве стандартного метода разделения полярных и неполярных метаболитов, несомненно, оправдано .

Однако, обращенно-фазовая хроматография применима для разделения лишь высокомолекулярных слабозаряженных соединений, тогда так сильнозаряженные соединения (например: производные углеводов, нуклеотиды и компоненты цикла трикарбоновых кислот и др.) и низкомолекулярные слабозаряженные соединения не удерживаются на используемых сорбентах [108]. Большинство метаболитов являются сильно заряженными (как отрицательно, так и положительно) низкомолекулярными гидрофильными соединениями, поэтому обращено-фазовая хроматография не всегда применима к анализу метаболома .

Ион-парная хроматография - метод жидкостной хроматографии, в котором удерживание анализируемого иона обеспечивается динамическим модифицированием сорбента с помощью добавления ион-парного агента (модификатора) в подвижную фазу. В этом методе используется обращеннофазовый сорбент, который модифицируется группами, обладающими ионообменными свойствами. Например, для разделения оснований в качестве модификатора используют алкилсульфат натрия, в таком количестве, чтобы рН поддерживался в диапазоне от 2 до 5. Для разделения аналитов с кислотными свойствами применяют соли тетра-алкиламмония (фосфат тетрабутиламмония, бромид цетилтриметиламмония и др.). Таким образом, метод ион-парной хроматографии позволяет провести разделение как положительно, так и отрицательно заряженных соединений на неполярном сорбенте. Основным недостатком ион-парной хроматографии является выраженная зависимость воспроизводимости результатов от стабильности системы и практически необратимое загрязнение всех частей хроматографа модификатором. Поэтому, несмотря на существование публикаций, в которых описывается применение ионпарной хроматографии при анализе метаболитов, этот метод не получил широкого распространения в метаболомике [109] .

Нормально-фазовая хроматография (НФХ) - это вариант жидкостной хроматографии, в котором подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, а основной фактор, определяющий удерживание - это взаимодействие аналитов с заряженными активными центрами сорбента. Разделение методом нормальнофазовой хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с полярными сорбентами, такими как силикагель или и оксид алюминия, имеющие на поверхности активные центры. В качестве элюента в нормально-фазовой хроматографии используют неполярные растворители, такие как н-гексан, нгептан, изооктан с небольшой добавкой метанола, этанола или изопропилового спирта (1-10%). В основе сорбции на поверхности заряженного сорбента лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью сорбента и полярными (или способными поляризоваться) группами молекул аналита. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями и образование водородной связи .

Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление необратимой сорбции компонентов смеси на сорбенте, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности разделения веществ и появлению продуктов деградации сорбента .

Практическое использование нормально-фазовой хроматографии крайне затруднено из-за низких относительных содержаний воды, содержащейся в растворителях, которая взаимодействует с адсорбционными центрами сорбента .

Гидрофильная хроматография (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC) успешно применяется для разделения полярных, слабокислых или слабоосновных образцов [110, 111]. Этот метод можно охарактеризовать как нормально-фазовую хроматографию на полярных колонках в водных элюентах с добавлением органических растворителей (обычно используют ацетонитрил) [103]. Отличительной особенностью этого метода является возможность использования разнообразных сорбентов для разделения полярных веществ: может быть использован как немодифицированный силикагель, так и колонки на основе силикагеля, модифицированного амино-, амидо-, циано-, карбамат-, диол- и полиоловыми группами, а также цвиттерионные (сульфобетаиновые или холинатные, получившие особое распространение в последние годы) и другие полярные стационарные фазы, химически связанные с носителем из силикагеля (рисунок 1). В гидрофильной хроматографии используются как положительно заряженные (сепарирующая фаза колонки состоит из амино-пропилированного силикагеля), так и отрицательно заряженные разделительные сорбенты (колонки на основе немодифицированного силикагеля, полиоловые сорбенты) [112] .

Также в гидрофильной хроматографии могут быть применены незаряженные хроматографические сорбенты, механизм удерживания аналита на которых заключается в образовании водородных связей. Например: циано водород связывает акцептор и не связывает донор) и амидные (водород связывается как с акцептором, так и с донором) силикагели. Некоторые полярные сорбенты демонстрируют гидрофобные свойства, которые позволяют разделить метаболиты, проявляющие слабые гидрофобные свойства наравне с полярностью [113] .

Рисунок 1. Строение разделительной фазы аналитических колонок .

Сорбент на основе немодифицированного (а), амино-пропилированного (б), циано-пропилированного (в) силикагеля, а также с полярными амидными (г) и диольными (д) группами и цвиттерионные фазы – сульфобетаиновая (е) и холинатная (ж) .

Метод гидрофильной хроматографии имеет ряд отличий от нормальнофазовой хроматографии. В частности, в отличие от нормально-фазовой хроматографии, в методе HILIC используются смешиваемые с водой органические полярные растворители, такие как ацетонитрил и метанол [114] .

Такие растворители обладают низкой вязкостью, что позволяет более эффективно разделить полярные соединения с помощью метода гидрофильной хроматографии по сравнению с обращено-фазовой хроматографией. Кроме того, высокое содержание органических веществ в подвижной фазе улучшает ионизацию в электроспрее масс-спектрометра, по сравнению с подвижными фазами с более высокими концентрациями воды, обычно используемой в обращено-фазовой хроматографии для разделения полярных соединений. Благодаря смешанному механизму удерживания, гидрофильная хроматография гораздо более эффективна в анализе сложных смесей, чем обращено-фазовая или стандартная нормальнофазовая, что является главной причиной растущей популярности этого метода .

[115, 116] .

2.3.2.4 Выбор оптимальных условий проведения хроматографического разделения метаболитов Эффективность разделения метаболитов с помощью метода жидкостной хроматографии зависит не только от выбранного режима проведения анализа (ОФХ, НФХ и HILIC) и от состава подвижной фазы и выбора сорбента, но и от условий проведения анализа (таких как: кислотность элюента и поддерживаемая температура). Для разделения метаболитов очень важным является выбор оптимальной кислотности элюентов. Кислотность подвижной фазы может оказывать влияние на удерживание веществ, влияя на ионизацию растворенного вещества и меняя свойства сорбента. Это явление связано с тем, что ионнообменный механизм значительно способствует удерживанию аналитов на заряженных сорбентах. Например, при значениях кислотности элюента меньшей, чем константа диссоциации pKa метаболита, имеющего кислотные свойства, метаболит становится менее гидрофильным за счет значительного снижения степени диссоциации на ионы, что приводит к снижению его удержания на полярных сорбентах. При значении кислотности элюента выше pKa такого метаболита, вещество преимущественно диссоциирует на ионы и хорошо удерживается полярным сорбентом за счет ионного взаимодействия .

Множество видов сорбентов для аналитических колонок может быть применено для анализа метаболома. Поэтому при исследовании метаболома важно выбрать тот сорбент и такие условия анализа, при которых будут получены наиболее полные и воспроизводимые результаты. В работе доктора Д. Рабиновича и его группы была протестирована эффективность разделения метаболитов в смеси с помощью 7 видов аналитических сорбентов различных производителей (Phenomenex, Thermo, Waters, Tosoh Biosciences) с использованием двух методов хроматографического разделения (обращено-фазовой и гидрофильной хроматографии ионного взаимодействия) при различной кислотности растворителей (pH=2.8, 5.8, 9.0 (в зависимости от устойчивости фазы тестировались не все точки pH)) (см. рисунок 2) [117]. Были протестированы следующие сорбенты: амино-пропилированный, циано-пропилированный силикагель, сорбенты с полярными амидными и фенильными группами, немодифицированный силикагель, графитовый сорбент и сорбент, модифицированный С18-алкильными группами .

В работе использовалась смесь аналитических стандартов из 144 веществ, входящих в состав метаболома клеток бактерии E. coli. Смесь была проанализирована при 18 указанных выше различных хроматографических условиях разделения (см. рисунок 2). Одной из задач цитируемой работы было выяснить, какая аналитическая колонка и при каких условиях является наиболее эффективной для анализа метаболома по следующим критериям: чувствительность методики, ширина и симметричность пика, отражающие характер удерживания и равномерность выхода метаболитов с аналитической колонки, удержание веществ сорбентом. Исходя из этих параметров результаты были классифицированы в зависимости от эффективности разделения стандартов на три группы- хорошие, удовлетворительные и плохие .

Худшие результаты разделения были получены с использованием графитовой колонки при щелочном значении pH 9 .

Лучшие результаты разделения были получены с использованием сорбента на основе аминопропилированного силикагеля при pH 9 и режиме анализа гидрофильная хроматография (77 метаболитов - разделение хорошего качества, 39- удовлетворительно разделены, итого 116 из 144 стандартов метаболитов). В щелочной среде сорбент на основе аминопропила лучше всего удерживает ионы и способен разделить максимальное количество различных метаболитов. Вероятной причиной эффективности разделения сорбента на основе аминопропилированного силикагеля в режиме гидрофильной хроматографии при щелочном pH является его способность удерживать метаболиты не только за счет ионообменного механизма, но и за счет образования водородной связи [113]. Причем сила этих взаимодействий уменьшается в воде, что создает условия для эффективного элюирования метаболитов водой. Однако в последующих исследованиях было показано, что методы анализа с использованием сорбентов на основе аминопропилированного силикагеля демонстрируют недостаточную воспроизводимость (за счет сдвига времени выхода) и малое время жизни колонки [114] .

Рисунок 2. Результаты оптимизации хроматографического разделения 144 метаболитов [117] .

Сорбенты: EPG - С18 со встроенной полярной группой; PH-фенильная модификация силикагеля; PGC- пористый графитизированный углерод; CN- цианопропильная модификация силикагеля; NH2-аминопропильная модификация силикагеля; SiO2-силикагель .

Стоит отметить, что в описанной работе не продемонстрирована эффективность разделения с помощью сорбента на основе силикагеля при повышенном значении pH, так как тестируемая колонка (Atlantis - HILIC column, Waters) не была устойчива к воздействию таких сред. Большинство коммерческих аналитических сорбентов на основе силикагеля неустойчивы при pH8.5. Однако при повышенном значении силикагель имеет максимальный заряд pH поверхности. Механизмом удерживания на сорбенте из немодифицированного силикагеля может быть адсорбция и ионный обмен в зависимости от природы аналита и состава подвижной фазы [118]. В работе доктора Фу и соавторов в 2013 году продемонстрировано, что аналитическая колонка с сорбентом на основе немодифицированного силикагеля с использованием метода гидрофильной хроматографии при pH 6.8 имеет лучшие показатели эффективности разделения сахаров среди множества других колонок (Silica, Diol, TSK Amide- 80, XAmide, Click Maltose, Click b-CD, и Click TE-Cys) [119]. Повышение pH подвижной фазы до pH 7.6 снижает степень удерживания соединений с основными группами в составе молекулы, но увеличивает разделение кислотных соединений [120] .

Сорбенты на основе силикагеля проявляют максимальную эффективность в отношении разделения большинства метаболитов в режиме гидрофильной хроматографии в с системе ацетонитрил/вода/буфер при рН, близких к 8.0. В отличие от химически модифицированных аналитических сорбентов, достоинство немодифицированного силикагеля в том, что он не теряет эффективности за счет деградации и отщепления специфических модифицирующих групп (см. таблицу 1). Однако следует отметить, что сорбент на основе силикагеля не может использоваться в течение длительного периода времени с рН подвижной фазы выше 8,5 из-за частичного растворения силикагеля, хотя такое растворение происходит медленнее в органических растворителях [114]. Из множества альтернативных сорбентов, именно силикагель признан максимально эффективным в разделении компонентов пиримидинового и пуринового метаболизма [112]. Силикагельные колонки, например Waters и Microsolv, демонстрируют превосходную стабильность даже при использовании элюентов при pH=7.8, время удерживания и эффективность разделения метаболитов стабильны даже при анализе большого количества образцов мочи [114] .

Несмотря на большое разнообразие применяемых модифицированных неподвижных фаз на основе силикагеля или органических полярных полимеров, простой силикагель, вероятно, является наиболее эффективным сорбентом в современных исследованиях метаболитов с использованием метода гидрофильной хроматографии [103] .

–  –  –

Метод: RP- обращено фазовая хроматография; HILIC- гидрофильная хроматография, тип сорбента: NH2- аминопропилированный силикагель; SiO2 – немодифицированный силикагель;

CONH2 сорбент на основе силикагеля, модифицированного амидной группой; ZICцвиттерионные сорбенты, например, сульфобетаиновые; Diol- сорбент на основе силикагеля, модифицированного двумя спиртовыми группами; CN - сорбент на основе силикагеля, модифицированного циано группой; C18- сорбент на основе силикагеля, модифицированного углеводородными группами с количеством атомов углерода -18 .

2.3.3 Детектирование и идентификация метаболитов

После того, как метаболиты были разделены, необходимо повести их детектирование в соответствии с молекулярной массой, структурой и зарядом .

Для детектирования метаболитов чаще всего используют следующие методы:

детектирование химического сдвига в спектре ядерного магнитного резонанса (ЯМР), измерение отношения массы к заряду (масс-спектрометрия), регистрация времени удерживания веществ на аналитической колонке или комбинация нескольких методов .

Явление ядерного магнитного резонанса (ЯМР) определяется как резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, обусловленное переориентацией магнитных моментов атомных ядер [121]. Обычно ЯМР наблюдают в сильном постоянном магнитном поле при воздействии второго слабого радиочастотного - поля, направленного перпендикулярно первому .

Спектроскопия ядерного резонанса подразумевает регистрацию переходов между энергетическими уровнями атомных ядер, вызываемых радиочастотным излучением. Методом ЯМР-спектроскопии регистрируют сигналы поглощения ядер, обладающих нечетным спиновым числом. Из ядер атомов, наиболее часто встречающихся в органических соединениях, магнитным моментом обладают ядра изотопов Н, С, O. Наибольшее распространение в F, P, N, исследовании органических веществ (в частности в метаболомике) имеет спектроскопия протонного магнитного резонанса (ПМР). Регистрируемым сигналом в методе ЯМР спектроскопии является химический сдвиг - это отличие резонансных частот ядер водорода, занимающих структурно неэквивалентные положения в молекуле от резонансной частоты поглощения стандартного вещества (чаще всего используют сигнал от поглощения тетраметилсилана) [122] .

Ввод пробы в ЯМР-спектрометр осуществляется с помощью специальной ампулы, в которой запаяно анализируемое вещество. ЯМР-спектроскопия позволяет изучить точную пространственную структуру молекулы вещества, однако этот метод характеризуется увеличенным, по сравнению с другими методами, временем проведения анализа и сложностью интерпретации полученных результатов [123, 124]. Одним из основных недостатков метода ЯМРспектроскопии является низкая чувствительность по сравнению с большинством других экспериментальных методов (оптическая спектроскопия, массспектрометрия и т.п.), что приводит к необходимости накопления сигнала. В некоторых случаях ЯМР-эксперимент может проводиться в течение даже нескольких недель. Другой недостаток метода с использованием ЯМРспектроскопии состоит в невозможности одновременно анализировать сложные смеси, так как компоненты смеси будут сильно влиять на регистрируемый сигнал химический сдвиг. Метод ЯМР-спектроскопии является чрезвычайно трудоемким при анализе метаболома клеток, однако способен демонстрировать превосходные результаты при выяснении структуры соединений .

Для метаболомных исследований метод масс-спектрометрического детектирования является незаменимым и в настоящее время наиболее часто применяемым [125]. Масс-спектрометрия имеет несколько существенных преимуществ перед методом ЯМР. Для анализа биологической жидкости не требуется проведения предварительной пробоподготовки, а линейная зависимость интенсивности полученных сигналов от количества вещества наблюдается в широких интервалах анализируемых концентраций [126]. Масс-спектрометрия является физико-химическим методом анализа, заключающимся в переводе образца в газообразную фазу и ионизации молекул с последующим разделением и регистрацией образующихся при этом ионов. Предварительно разделенные на фракции с помощью хроматографии ионы сортируются по величинам отношения масса/заряд (m/z), затем регистрируется число ионов характеризующихся одинаковым значением m/z. Полученный масс-спектр позволяет сделать выводы о молекулярной массе соединения, его элементном составе и частично дает информацию о структуре вещества [127]. Следует отметить, что метод массспектрометрии позволяет проводить детектирование как положительно, так и отрицательно заряженных ионов .

В настоящее время наряду с возможностью прямого ввода образца в ионизационную камеру масс-спектрометра стала обычной практика объединения масс-спектрометра с газовым (ГХ-МС) или жидкостным (ЖХ-МС) хроматографом. Таким образом, к характеристике ионов, детектируемых массспектрометром, добавляется такая характеристика, как время удерживания вещества на сорбенте. Современные масс-спектрометры могут измерять массу иона с точностью, достаточной для определения атомного состава. Методы дробления ионов молекул на фрагменты путем соударения разогнанных ионов с частицами инертного газа (фрагментация) и регистрация осколочных ионов позволяют определить структуру молекулы, сравнивая полученные спектры со спектрами стандартных веществ. Фрагментация происходит избирательно, является высоковоспроизводимой и характерной для данного соединения. Кроме того, с помощью масс-спектрометрии можно проводить количественный анализ содержания вещества в пробе, так как интенсивность сигнала зависит от количества детектируемых ионов .

Масс-спектрометрическое детектирование может осуществляться с использованием квадрупольных масс-спектрометров (Q, QQQ) и ионных ловушек (i-TRAP), с помощью высокоточного времяпролетного масс-спектрометра (TOF) [16, 128] или масс-анализатора ионно-циклотронного резонанса с Фурьепреобразованием (FTICR) [129]. С точки зрения масс-спектрометрической идентификации, инструменты на основе тройных квадруполей являются надежными и оптимально подходят для количественного измерения точно известных метаболитов. Детекторы высокого разрешения с возможностью полного сканирования спектра (например, времяпролетный) также позволяют провести достоверные количественные измерения известных метаболитов а также предоставляют данные о неизвестных соединениях в составе метаболома .

Различные типы масс-спектрометров могут быть комбинированы в гибридных приборах [130], например, квадрупольный и времяпролетный массспектрометры В контексте универсальности анализа, наиболее Q-TOF .

эффективны гибридные масс-спектрометры, сочетающие в себе возможность проведения точных качественных и чувствительных количественных измерений с последующей фрагментацией ионов .

Инструментальное развитие масс-спектрометрии в настоящий момент направлено в основном в сторону разработки более чувствительных инструментов с высоким разрешением. Повышение чувствительности позволяет увеличить количество метаболитов, которые могут быть измерены, а лучшее разрешение по массе позволит снизить влияние «шумовых» загрязнений и уменьшить риск неверной идентификации соединений .

В настоящее время, с применением множества специально разработанных методов анализа могут быть идентифицированы по отдельности практически все внутриклеточные метаболиты. Одной из основных задач метаболомики является анализ как можно большего числа метаболитов. Однако проанализировать весь набор метаболитов единственным аналитическим методом практически невозможно. Поэтому для получения полного представления об устройстве клеток и механизмах регуляции микроорганизмов наиболее эффективно использовать несколько методов разделения и идентификации [131, 132]. При комбинации высокоточной масс-спектрометрии с эффективной пробоподготовкой и хроматографическим разделением веществ достигается высокая чувствительность и специфичность, а также широкий динамический диапазон измерений [75, 133, 134] .

При анализе метаболитов особенно эффективен метод ВЭЖХ-МС, включающий в себя разделение метаболитов с помощью гидрофильной хроматографии с последующей электроспрейной ионизацией и массспектрометрическим детектированием в отрицательном и положительном режимах записи спектра [117, 135, 136]. В некоторых случаях, ГХ-МС, ЯМРспектроскопия, а также капиллярный электрофорез, совмещенный с массспектрометрией [70], могут в значительной степени заменить ВЭЖХ-МС метод .

Однако время, затрачиваемое на пробоподготовку (дериватизации аналитов), необходимую для использования газовой хроматографии, совмещенной с массспектрометрией значительно больше времени, затрачиваемого на пробоподготовку в ВЭЖХ-МС методе. Кроме того, использование высокоточного и тандемного масс-спектрометрического оборудования позволяет получить информацию о структуре вещества, устраняя тем самым необходимость использования ЯМР-спектроскопии. Метод ВЭЖХ-МС позволяет быстро разделить и идентифицировать метаболиты в сложной смеси. Таким образом, высокоэффективная жидкостная хроматография с последующим получением масс-спектра в отрицательном и положительном режимах анализа является неотъемлемой частью метаболомных исследований [137] .

2.4 Обработка данных и интерпретация результатов анализа метаболитов

Технологии, используемые в метаболомике, позволяют получить большие объемы данных, поэтому обработка таких сложных наборов данных является важным этапом для правильной интерпретации результатов. Задачу анализа результатов в метаболомике условно можно разделить на два этапа: обработка данных и интерпретация полученных результатов. Первый этап анализа результатов состоит из обработки исходных МС-данных и объединения данных между несколькими измерениями и поиск отличий между группами данных. Этап интерпретации обработанных данных включает в себя идентификацию метаболитов и выявление метаболических путей, участвующих в различных механизмах регуляции клетки .

2.4.1 Обработка полученных данных

Результаты масс-спектрометрического анализа метаболома представляют собой файлы с набором данных. Один файл с данными ЖХ-МС анализа является коллекцией последовательно записанных гистограмм, каждая из которых, представляет наборы сигналов от ионизированных молекул на детекторе за небольшой промежуток времени [138]. Гистограмма состоит из набора m/z (молекулярная масса/заряд иона) значений и интенсивности соответствующих сигналов. Основная цель обработки данных состоит в преобразовании исходных данных в файлы в таком представлении, которое облегчает доступ к характеристикам каждого наблюдаемого иона. Эти характеристики включают m/z, время удерживания иона и интенсивность сигнала в каждый момент времени .

В процессе обработки данных может быть извлечена дополнительная информация об изотопном расщеплении иона. Различные производители приборов используют различные форматы данных, предварительным шагом для обработки данных в программном обеспечении является преобразование таких специфичных форматов в общий формат, например: netCDF или mzXML [139]. Затем непосредственно приступают к процессу обработки данных, как правило, включающему несколько этапов: фильтрацию шума, обнаружение пиков соответствующих ионам метаболитов, выравнивание ионных хроматограмм и нормализацию спектров (рисунок Далее проводят статистический 3) .

сравнительный анализ обработанных данных разных групп образцов [140] .

Рисунок 3. Алгоритм обработки масс-спектрометрических метаболомных данных .

Преобразованные в удобный для работы формат данные подвергаются процедуре фильтрации шумовых сигналов для снижения вероятности ложноположительного обнаружения. Фильтрация и сглаживание сигнала чаще всего проводятся с помощью определения базовой линии отсечения интенсивности и минимального значения отношения сигнал/шум. Эти параметры используются для выделения из полученных данных сигналов, соответствующих измеренным ионам. Существуют и другие алгоритмы поведения фильтрации сигнала, например, сопоставление формы МС-пиков (а точнее коэффициентов функции, описывающей форму данного пика) с теоретически предсказанной на основе Гауссовых функций формой пика. Для дальнейшего обнаружения сигналов, соответствующих ионам, чаще всего используются автоматизированные алгоритмы, однако в отдельных случаях все еще требуется предварительная настройка параметров выявления идентификаций [140]. Для того, чтобы объединить или соотнести предварительно обработанные результаты анализа в различных образцах на следующем этапе обработки данных проводят выравнивание времени удерживания веществ в хроматограмме и нормализацию сигналов в спектре .

Одним из самых важных этапов для анализа наборов метаболомных данных является процедура выравнивания сдвигов по времени удерживания веществ .

Такая процедура сопряжена с определенными техническими трудностями. Тем не менее, разработано множество алгоритмов выравнивания спектров по этому параметру В данных, полученных с помощью хромато-массспектрометрического метода анализа, изменение времени удерживания веществ является нелинейным, поэтому для коррекции этого параметра были разработаны сложные многоступенчатые методы [142]. Существует три основных метода проведения выравнивания спектров - корреляционный метод и методы параметрического и динамического смещения времени удерживания .

Корреляционный метод выравнивания времени удерживания веществ (COW), это метод, в процессе применения которого, хроматограмма делится на множество частей и проводится отдельная коррекция этого параметра в каждом сегменте [143]. Деление хроматограммы на множество сегментов приводит к повышению точности коррекции времени удерживания, однако возникает риск деления интересующего пика не отдельные сегменты. Другой способ коррекции времени удерживания веществ метод параметрического сдвига Метод

- [144] .

параметрического сдвига позволяет выровнять все хроматограммы относительно одной, выбранной за опорную. В качестве эталона для коррекции выбираются пики точно известных соединений в опорной хроматограмме и, по возможности, пики внутренних стандартов (предварительно добавленные в анализируемую смесь вещества с точно известной массой и временем выхода). Такой метод позволяет быстро скорректировать время удерживания веществ. Недостатки метода в основном сопряжены с возможным физико-химическим взаимодействием внутреннего стандарта с компонентами анализируемой смеси .

Еще один метод коррекции времени удерживания веществ - метод динамического смещения (DTW) [145]. В процессе применения метода DTW в спектрах автоматически определяются масс-спектрометрические сигналы в спектре, представленные в каждом наборе данных, и по ним проводится корректировка временных характеристик сигнала. Существуют несколько протоколов проведения динамической коррекции, оптимизированные для различных видов данных, что позволяет снизить возможность появлениях параметрических ошибок .

Полученные МС-данные характеризуются не только временем удерживания ионов, но и значениями m/z, однако за счет влияния внешних факторов (таких как изменение температуры) происходит сдвиг точных значений детектируемого отношения m/z. Особенно это характерно для высокоточных приборов, таких как, используемые в нашей работе времяпролетные массспектрометры. Поэтому немаловажно кроме коррекции времени удерживания веществ в полученных спектрах провести уточнение получаемых значений отношения m/z детектируемых ионов. Некоторые приборы позволяют снизить влияние внешних факторов на детектируемые значения за счет дополнительной калибровки масс на стандартное вещество непосредственно во время проведения анализа. Также можно провести калибровку значений m/z уже после проведения анализа с использованием точных значений масс ионов, имеющихся в спектрах [146] .

Этапом обработки МС-данных, позволяющим исключить систематическую ошибку и позволяющим выявить истинные отличия между образцами, является нормализация полученных данных. Нормализация заключается в приведении значений интенсивностей сигналов анализируемых ионов в разных спектрах относительно постоянной величины [147]. За постоянную величину принимают интегральную интенсивность сигнала одного или нескольких стандартных веществ, добавленных в пробу (внутренних стандартов), или общий ионный ток (суммарное значение интенсивностей детектированных ионов). В качестве внутреннего стандарта выбирают вещество, имеющие схожие с анализируемыми метаболитами физико-химические свойства и не взаимодействующее с компонентами пробы. Наиболее часто в качестве внутреннего стандарта в метаболомных исследованием выбирают изотопно-меченые метаболиты [147] .

Изотопно-меченые метаболиты проявляют те же свойства, что и исследуемые метаболиты и имеют равные шансы на деградацию в процессе пробоподготовки и анализа. Нормализация сигналов на интенсивность сигналов внутренних стандартов позволяет нивелировать возможное влияние изменений условий окружающей среды на полученные результаты и провести количественное сравнение содержания метаболита в разных пробах [148] .

Следующим этапом анализа масс-спектрометрических данных является поиск достоверных количественных отличий в спектрах двух или нескольких групп образцов. Такой поиск проводится на основании алгоритмов статистического анализа. Для сравнения количественного содержания вещества в пробах используют такой параметр, как интегральная интенсивность сигнала, соответствующего исследуемому иону .

Повышение спроса на автоматизированные алгоритмы обработки данных привело к разработке ряда новых программных проектов. В настоящее время разработано множество программ, позволяющих обработать данные, существуют как свободно доступные, так и коммерческие проекты. Одно из различий между коммерческим и бесплатным программным обеспечением можно определить как открытость методов реализации анализа. В свободно доступных программах параметры используемых алгоритмов могут быть откорректированы пользователем. Большинство алгоритмов включает в себя все этапы обработки данных, а также существуют программы, предназначенные для решения конкретных задач. Например, программа, находящаяся в свободном доступе, COMSPARI направлена на визуализацию результатов с целью улучшения поиска различий между парами образцов [149]; другая программа MET-IDEA позволяет получить данные о значении ионной интенсивности для указанного иона/времени удержания [150]; MZmine и XCMS позволяют провести фильтрацию шумовых сигналов, обнаружение пиков, выравнивание, нормализацию спектров и статистический анализ результатов в разных группах сравнения [5, 151] .

Перечисленные программы позволяют провести обработку данных полученных как с помощью ГХ-МС, так и с помощью- ЖХ-МС методов анализа .

2.4.2 Способы интерпретации полученных результатов

В результате обработки данных, полученных при анализе метаболома, получают список детектированных пиков и/или список достоверных отличий между разными группами данных [140]. Каждому пику соответствует значение m/z иона вещества, причем точность полученного значения соответствует выбранному методу детекции. Все полученные данные необходимо сопоставить со значениями m/z метаболитов и провести идентификацию анализируемых веществ. В большинстве случаев этот этап обработки данных анализа автоматически включен в функции программы, выполняющей обработку данных, необходимо только выбрать метаболомную базу данных или создать свою базу данных, по которой будет проводиться поиск соответствий. В нашей работе мы использовали базу данных, созданную нами на основе метаболических реконструкций и предсказанных внутриклеточных веществ исследуемых видов молликут .

Идентификация интересующих ионов проводится с помощью поиска соответствий полученных значений m/z с истинными значениями m/z ионов веществ в заданном интервале отклонений значения этой величины. Однако зачастую точности полученного значения m/z не достаточно для того, чтобы однозначно идентифицировать вещество, так как существует множество метаболитов со схожими значениями этого параметра. В таком случае используют метод получения спектров фрагментации вещества с использованием МС/МС анализа заданного иона. Полученные спектры фрагментации содержат информацию о массах фрагментов исходного иона и об относительной интенсивности сигнала фрагментов в спектре. Такие спектры точно характеризуют структуру вещества, поэтому подтверждение идентификации детектированного иона можно проводить на основании соответствия спектров фрагментации исследуемого вещества со спектром, полученным для стандартного вещества .

Для интерпретации результатов, полученных с помощью качественной и количественной метаболомики, могут быть использованы универсальные биохимические базы данных. Такие базы данных могут предоставлять информацию о структуре идентифицированного вещества и его биологической функции. Информация о биохимических путях и метаболитах, участвующих в этих путях, имеется в базе данных KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) и в базе данных BioCyc (http://biocyc.org/) [152]. Это общие базы данных, позволяющие визуализировать метаболические пути, их взаимосвязь, ферменты, катализирующие реакции, и подробную информацию о каждом элементе метаболического пути, включая точную массу метаболита и его структуру .

Существуют более узконаправленные базы данных, например, базы данных для анализа липидома: LipidMaps (http://www.lipidmaps.org/data/index.html), и Lipid Bank SphinGOMAP (http://sphingomap.org/), (http://lipidbank.jp/index00.shtml), которые содержат структурную и номенклатурную информацию о липидах, а также стандартные аналитические протоколы. Общая информация о физико-химических свойствах метаболитов может быть получена путем поиска в общих химических базах данных, таких как PubChem или CAS. Поиск по общим базам данных может быть также полезен для определения химической структуры неизвестных соединений. Например, поиск в базе Merck Index используется для выявления неизвестных загрязнителей воды Метаболомная база данных Гольма (GMD, [153]. http://csbdb.mpimpсодержит общедоступные масс-спектры, golm.mpg.de/csbdb/gmd/gmd.html) индексы удержания метаболитов (MSRI) и ГХ - МС метаболические профили образцов растений [154]. База данных METLIN (http://metlin.scripps.edu/) содержит данные о метаболитах и ссылки на общие химические базы данных, МС/МС спектры, полученные в различных условиях ионизации и ЖХ-МС профили метаболитов в образцах плазмы и мочи человека [155]. На сегодняшний день существующие метаболические базы данных направлены, в первую очередь, на структурную идентификацию метаболитов в различных биологических образцах. Ожидаемым направлением развития в метаболомике является разработка баз данных, содержащих количественные данные о содержании веществ в организмах. Примером этого типа баз данных является база данных человеческих метаболитов HMDB (http://www.hmdb.ca/), которая содержит данные о более чем 41500 метаболитах и 440 метаболических путях человека и объединяет в себе информацию, содержащуюся в базах данных KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniPro, и GenBank. Главная особенность этой базы данных состоит в том, что она содержит информацию о количественном содержании метаболитов в биологических жидкостях в нормальном или патологическом состоянии организма человека .

Интерпретацию данных количественного сравнения метаболитов проводят с использованием предварительно реконструированных схем метаболизма. Вывод об участии метаболического пути в адаптации клеток к различным воздействиям, в механизмах взаимодействия патогена с организмом-хозяином и других механизмах регуляции метаболизма клетки делают на основании изменения содержания метаболитов, участвующих в этом пути, при определенном воздействии .

–  –  –

2.5.1 Применение качественного анализа метаболитов Основной и первоначальной целью метаболомики является функциональная аннотация генов [6-8]. Как уже говорилось выше, для штамма с делетированным ферментом, ожидаемым изменением в метаболоме является накопление субстратов реакций, катализируемых соответствующим ферментом .

Например, наиболее сильно изменяющимся соединением в штамме дрожжей после удаления гена YKL215C был оксопролин, что является биохимическим подтверждением аннотации YKL215C как оксопролиназы [156]. Расширение производительности методов анализа метаболома вскоре позволит проводить такие анализы в масштабе генома и даже автоматизировать процесс [157] .

Для известных метаболических путей исследование метаболитов может служить мощным инструментом для демонстрации функционирования пути .

Примером использования метаболомных исследований для демонстрации активности метаболического пути может служить исследование метаболизма В перспективном в области исследования Clostridium acetobutylicum .

биоэнергетики организме C. acetobutylicum, наличие цитрата в метаболоме послужило доказательством существования и функционирования ЦТК (цикл трикарбоновых кислот), несмотря на отсутствие аннотации ферментов [12] .

Для хорошо изученных метаболических путей с помощью метаболомики представляется возможным исследовать направления протекания реакций. Так, например, добавление С13-меченного глутамина в питательную среду для малярийного паразита Plasmodium falciparum показало, что цикл реакций ЦТК может раздваиваться. В дополнение к обычному направлению цикла Кребса по часовой стрелке от -кетоглутарата через сукцинат в малат, он также течет против часовой стрелки через цитрат в ацетил-КоА и малат [11]. Полученный раздвоенный цикл окислительно-восстановительно сбалансирован и обеспечивает образование двух единиц углерода. Уникальные ферменты, участвующие в обмене веществ P. falciparum, могут стать важными лекарственными мишенями .

Другой пример применения метаболомных данных представлен исследованием организмов, известных как метилотрофы, имеющие промышленное значение благодаря их способности производить сложные молекулы из метана или метанола. Метанол усваивается ими в реакции с глицином с последующим получением аминокислоты серин. Долгое время оставалось неясным, каким образом в организме Methylobacterium extorquens производится глиоксилат, углеродный скелет глицина. Одна из гипотез включала серию реакций из девяти стадий, которые не были продемонстрированы ни в одном организме. Недавно группа ученых под руководством профессора Пейрауда продемонстрировала наличие каждого из метаболитов этого пути в клетках организма M. extorquens с использованием ВЭЖХ-МС системы высокого C13-меченный ацетат, они показали разрешения [10]. Кроме того, используя порядок протекания реакций в исследованном пути синтеза глиоксилата .

Доказательство существования пути биосинтеза глиоксилата привело к возрастанию общего интереса к М. extorquens как промышленному организму .

Для определения новых метаболических путей, трудной задачей все еще остается идентификация неизвестных соединений. Способность предсказывать структуру, исходя из данных масс-спектрометрической фрагментации соединения, имеет большое значение в метаболомике. Расшифровка спектров неизвестного вещества чрезвычайно трудоемкий процесс, основанный на знании основных закономерностей фрагментации соединений [158]. В настоящее время для подтверждения идентификаций в основном опираются на экспериментальные данные фрагментации стандартов веществ (используя химически чистые вещества). Так в клетках E.coli было продемонстрировано наличие нового пути катаболизма пиримидинов с помощью фрагментации идентифицированных ионов и сравнения спектров с существующими базами данных [9, 159] .

Кроме возрастающего в последнее время интереса к метаболическому профилированию микроорганизмов, качественный анализ метаболома используется для решения широкого спектра задач в различных областях, включая синтетическую биологию, медицину и прогнозируемое моделирование растительных, животных и микробных систем .

2.5.2 Применение количественного анализа метаболитов

Современные методы метаболомного анализа позволяют измерить динамику взаимодействия различных соединений. Это дает возможность получить представление о метаболическом регулировании. Например, недавно была изучена концепция метаболической регуляции взаимодействия фермента с субстратами в клетках S. cerevisiae [13, 14]. Исследования касались феномена быстрого истощения адениннуклеотидов при добавлении глюкозы к культуре дрожжевых клеток. Избыток глюкозы, как можно было бы ожидать, должен приводить к быстрому превращению АТФ в АДФ, так как запускается гексокиназная реакция. Тем не менее, уменьшение содержания АТФ происходит без соответствующего увеличения АДФ или АМФ. Для исследования этого феномена, группа профессора Вольтера использовала ЖХ-МС метод анализа Они определили, что снижение содержания АТФ может быть [160] .

компенсировано не за счет увеличения содержания АМФ, а за счет увеличения концентрации промежуточных соединений пуриновых нуклеотидов - инозина и инозинмонофосфата. АДФ, произведенный с помощью гексокиназы из АТФ, преобразуется ферментом аденилаткиназой в АМФ, который затем подвергается действию деаминазы до превращения в инозинмонофосфат. Этот путь деградации AMФ специфически активируется в клетках E.coli при наличии избытка гексозы в среде. В условиях энергозатрат, наличие такого пути метаболизма дает клеткам преимущество, так как присутствие гексозы гарантирует поступление адекватного количества долгосрочной энергии клеткам. Этот путь запасания важен для того, чтобы избежать временного накопления AMФ, сигнализирующего клетке об ограничении в источнике энергии. Кроме того, деградация AMФ гарантирует, что АТФ будет предпочтительным соединением для активных центров ферментов .

Описанное исследование подчеркивает важность распределения внутриклеточных метаболитов в клетках микроорганизмов в соответствующих условиях окружающей среды. В работе был описан механизм регуляции энергетического состояния клетки, индикатором которого является метаболит AMФ - признак недостаточности энергии. В рассмотренном случае энергия тратилась на то, чтобы избежать возможности накопления АМФ или AДФ, связывающимися с активными центрами ферментов вместо богатого энергией АТФ. Регулируемые изменения концентрации метаболитов в различных условиях роста культуры увеличивают способность клеток приспосабливаться к изменениям во внешней среде .

Существует две главных цели внутриклеточного регулирования метаболических путей: оптимизация потоков метаболитов и поддержание гомеостаза в клетках на метаболическом уровне.

Одновременное решение этих задач зачастую приводит к значительным изменениям в метаболоме:

концентрация веществ может изменяться более чем в десятки раз. Например, в клетках дрожжей, попавших в условия недостатка азота, быстро понижается внутриклеточное содержание аминокислот. При этом не снижается скорость деления клеток, по крайней мере, в пределах одного поколения [6] .

Разобщенность ферментов одного метаболического пути также предоставляет собой потенциальный источник устойчивости метаболической системы [82]. Пример такой устойчивости - способность клеток бактерий E. coli при отсутствии фермента пентозофосфатного пути - трансальдолазы (talAB) поддерживать рост за счет небольшого количества ксилозы, несмотря на значительное накопление седогептулозо-7-фосфата [82]. Группа ученых под руководством профессора Накахигаши доказали, что метаболические ферменты реакций одной метаболической ветви катализируют реакции независимо друг от друга [161]. При удалении гена, ответственного за фермент трансальдолазу, в клетках E. coli в значительном количестве накапливается седогептулозо-7-фосфат, и конкурирует с фруктозо-6-фосфатом за связывание с активным сайтом фосфофруктокиназы. Тест показал, что последующее фосфорилирование приводит к образованию седогептулозо-1,7-дифосфата, который затем гидролизуется до дигидроксиацетонфосфата и эритрозо-4-фосфата с помощью фруктозо - бисфосфатальдолазы. Это обеспечивает катаболизм ксилозы при отсутствии трансальдолазной активности. Этот альтернативный переход может поддерживать около 90% скорости роста бактерий дикого типа [161] .

При удалении определенного гена, способность поддерживать гомеостаз отражает внутренняя устойчивость метаболической сети. Для большей части реакций основных путей обмена веществ в условиях, когда один путь не активен, другой - автоматически замещает его функцию. Например, для E. coli удаление гена, кодирующего фермент глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, препятствует стандартному пути получения рибозо-5-фосфата важного компонента биосинтеза нуклеиновых кислот. Соответственно уровень содержания этого метаболита сильно падает [6]. Независимо от уровня содержания ферментов, изменение концентрации этого метаболита приводит к изменению метаболического потока, проходящего через неокислительную часть пентозофосфатного пути. Направление химических превращений меняется на реакции метаболизма фруктозо-6-фосфата до рибозо-5-фосфата, обеспечивая синтез необходимого метаболита. Такие изменения в потоках метаболических путей позволяют клетке адаптироваться к изменению в геноме .

Метаболический ответ на изменение условий окружающей среды отличается скоростью и специфичностью [162]. Скорость метаболического ответа обусловлена мгновенными химическими превращениями компонентов метаболизма, а его специфичность обусловлена прямыми взаимосвязями между реакциями внутриклеточного биосинтеза и наличием субстрата реакций в питательной среде. Например, в клетках дрожжей увеличение концентрации глутамина является прямым индикатором накопления аммиака в клетке, так как регулирует его содержание, а концентрация АТФ является индикатором количества неорганического фосфора и ее регулятором [163]. Скорость и специфичность ответных реакций на воздействие позволяют метаболитам служить надежными сигналами изменений в окружающей среде .

–  –  –

Для любого исследования на системном уровне очень важным является понимание как структуры и функций самих компонентов системы, так и того, как именно эти компоненты взаимодействуют между собой. В настоящий момент в литературе накоплено множество данных о содержании метаболитов в клетках разных видов бактерий [164]. Реконструкции метаболизма организмов с очень малыми геномами близятся к завершению Кроме того, методы [3] .

количественного анализа компонентов метаболических путей (метаболитов и белков) являются доступными [165]. Однако, ключевой вопрос, который возникает при реконструкции метаболизма, состоит в получении возможности количественно прогнозировать метаболомный ответ на воздействия внешней среды. Для прокариот наиболее актуальной задачей в контексте прогнозирования поведения клетки является количественное интегрирование всех накопленных данных. Точные данные абсолютного количественного измерения содержания метаболитов в клетках при воздействии различных факторов позволит провести такое интегрирование .

Прогресс в развитии экспериментальных возможностей и вычислительных подходов метаболомики, необходимых для решения основных вопросов системной биологии, по существу, должен включать три направления. Первым и ключевым направлением является разработка методов проведения экспериментов с высокой пропускной способностью для выявления и количественной оценки концентраций метаболитов. Вторым направлением развития методических подходов в метаболомике является развитие вычислительных алгоритмов для анализа сложных наборов данных, позволяющих интерпретировать результаты с высокой точностью. Первые два направления развития рассматривают определение и количественную оценку содержания метаболитов и их изменения под воздействием различных факторов. Третья ветвь развития метаболомных подходов к решению вопросов системной биологии направлена на понимание того, как возникает определенная биологическая реакция клетки на воздействие, когда взаимодействуют различные компоненты клетки. В основном третья ветвь касается согласования экспериментальных данных и математического моделирования поведения клетки. Существенное значение для решения этой задачи имеют сложные математические модели, позволяющие понять и спрогнозировать поведение организма как единой системы .

Необходимым прогрессом для развития методических подходов в анализе метаболома является разработка способов выделения метаболитов с учетом их внутриклеточной локализации. Все существующие методы выделения метаболитов подразумевают смешивание метаболитов из различных субклеточных отделов. Наиболее перспективным решением этого вопроса кажется прямое измерение концентраций метаболитов в живых клетках и субклеточных отделах флуоресцентными методами [166]. Разнообразие химических свойств метаболитов требует огромного количества специфических белковых сенсоров, дефицит которых в настоящее время ограничивает эти методы. Достижения в области дизайна связывающих белков должны ускорить появления методов измерения метаболитов в живых организмах. Концентрации сотен метаболитов будут измерены в реальном времени и с учетом их расположения в клетке .

Еще одной областью развития метаболомных подходов является разработка методов анализа метаболитов индивидуальной клетки. Работая в области бактериальной метаболомики, мы вынуждены рассматривать изменения в клетках усредненные по некоторому количеству предположительно однородной культуры, выросшей при одинаковых условиях. Это связано, в первую очередь, с чувствительностью современного детектирующего оборудования, которое не позволяет детектировать малые концентрации метаболитов в одной клетке .

Способность детектировать, идентифицировать и количественно измерить метаболиты в единичной клетке в настоящее время является одной из самых сложных технических задач в метаболомике. Исследования индивидуальной клетки часто направлены на выявление различий внутри клеточных популяциях .

Данные таких исследований являются важным компонентом моделирования в системной биологии. Однако чрезвычайная изменчивость и реакционная способность метаболитов делает трудной задачу моделирования состава и динамики клеточного метаболома [167] .

В последнее время в области разработки и применении биоаналитических инструментов для детектирования метаболитов в одной клетке был достигнут значительный прогресс за счет использования масс-спектрометрии, микрофлюидики, и капиллярных разделений. Для исследования метаболома одной клетки применяют такие методы, как микрофлюидика, капиллярная ЖХ и капилярный электрофорез, соединенный с различными методами обнаружения, такими как лазерно-индуцированная флуоресценция и масс-спектрометрия .

Значительную сложность в анализ метаболома одной клетки вносит пробоподготовка, которая должна проводиться без пертурбаций метаболома .

Размер бактериальной клетки (0,5-5,0 мкм) и низкие концентрации метаболитов делают бактерии сложным объектом для анализа метаболома индивидуальной клетки. Например, клеточные концентрации метаболитов бактерии M. pneumoniae (они относятся к классу молликут и являются одними из ближайших родственников бактерий, исследуемых в нашей работе) были измерены с помощью анализа метаболома большого количества культуры, подсчета количества клеток и усреднения результатов на одну клетку. Полученные средние концентрации составляют от 0,1- 3,3 мМ каждой аминокислоты, 15-60 мМ глюкозы (в зависимости от фазы роста), метаболиты гликолиза составляют малую долю от содержания всех веществ в клетке - это примерно 0,03-1,1 мМ каждого соединения, азотистые основания представлены в концентрациях около 5 мМ. Для сравнения, в клетке E. coli содержится примерно 113 мМ аминокислот, а в клетках M. pneumoniae 15,5 мМ [168]. Поэтому для анализа метаболитов в клетке необходимо использовать высокочувствительные методы детектирования, такие как комбинационная микроспектроскопия (RMS), Фурье-спектроскопия (FTIRS) и масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS) [169, 170]. Наиболее перспективные методы в метаболомике одной клети - это потоковая цитометрия в комплексе с масс-спектрометрией [171, 172]. Такую комбинацию методов можно применить для количественного анализа более чем 34-х параметров, включая ДНК содержание, относительный размер клетки и жизнеспособность клеток .

Поскольку главная задача масс-цитометрии состоит в исследовании белков единичной клетки, использование этого метода в метаболомике еще не проводились, несмотря на наличие большого количества антител. Значительное улучшение чувствительности существующих методов позволит исследовать несколько метаболитов одновременно в составе одной клетки [173] .

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

–  –  –

Штамм бактерии Spiroplasma melliferum КС3 и Acholeplasma laidlawii PG-8A предоставлен профессором Г. Вроблёски, университета Ренна, Франция. Штамм бактерии предоставлен профессором С.Н .

Mycoplasma gallisepticum S6 Борхсениусом, ФГБУН интститут цитологии РАН, Россия. Бактерии Spiroplasma melliferum КС3 культивировалась в среде SP4, специальной аэрации или перемешивания не проводилось .

Бактерии Spiroplasma melliferum КС3 культивировались при температуре термостатирования 30°С в течении 20 часов при разбавлении 1:10 [174]. Бактерии Acholeplasma laidlawii PG-8A и Mycoplasma gallisepticum S6 культивировались в модифицированной среде Эдварда (состоящей из триптозы в концентрации 20 г/л, NaCl 5 г/л, NaAc 5 г/л, KCl 1.3 г/л, Tris 3 г/л, дрожжевого диализата 5%, лошадиной сыворотки 6% (термически инактивированной при 56°С - 30 мин), глюкозы 0.5%, pH 7.5). Бактерии A. laidlawii PG-8A и M. gallisepticum S6 культивировались при температуре термостатирования 37°С в течении 20 часов при разбавлении 1:100. Бактерии культивировались в закрытых колбах [175] .

Клетки собирали центрифугированием (в течение 15 мин, при скорости 16000 g) в средней логарифмической фазе роста, контролируемой по значению pH (6,5-6,6) из 50 мл культуры, и затем промывались раствором 150 мM раствора NaCl как описано в параграфе «Экстракции метаболитов». Метаболические профили были получены из культур, выращенных из одного клона. Для проведения исследования метаболома было проведено семь биологических повторов каждого эксперимента .

–  –  –

Чтобы определить способность молликут выжить в кислых условиях и оценить критическое значение рН для каждого вида, мы использовали метод «цветового теста» .

3.2.1 Определение устойчивости культуры к кислотному воздействию Аликвоту (1мл) культуры М. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum подвергали воздействию пониженной кислотности (рН доводили с помощью соляной кислоты) с шагом pH = 0,1 в течение 1 часа, начиная с рН 7,5. Затем каждую аликвоту подвергали серии разбавлений (до 10-9) в нормальной культивационной среде (рН 7,5), содержащей индикатор рН (феноловый красный). Затем весь набор разбавлений оставляли до полного проращивания для определения порядка содержания живых клеток в исходной пробирке. В процессе жизнедеятельности молликуты вырабатывают и выделяют в среду лактат, в результате чего изменяется кислотность питательной среды. Поэтому наличие живых клеток, способных к делению и росту культуры определялось по изменению цвета индикатора, добавленного в питательную среду (при понижении кислотности индикатор меняет окраску с красной на желтую). Сублетальная доза воздействия определялась как наибольшая, при которой порядок колониеобразующих единиц оставался таким же, как и в контрольном образце .

3.2.2 Определение устойчивости культуры к осмотическому воздействию Аликвоту (1мл) культуры М. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum подвергали осмотическому воздействию (с помощью увеличения концентрации хлорида натрия) с шагом СNaCl = 100 мМ в течение 1 часа. Затем каждую аликвоту подвергали серии разбавлений (до 10-9) в нормальной культивационной среде (СNaCl = 150 мМ), содержащей индикатор рН (феноловый красный). Затем весь набор эппендорфов оставляли до полного проращивания для определения порядка содержания живых клеток в исходной пробирке .

Уровни сублетальных воздействий в течение часа составили: для М .

gallisepticum: pH= 4,8 - для теплового стресса, 1,0 М NaCl – для осмотического стресса для A. laidlawii: pH= 5,2 - для теплового стресса, 0,8 М NaCl – для осмотического стресса и для S. melliferum: pH=5,1 - для теплового стресса, 0,8 М NaCl – для осмотического стресса. Для исследования солевого воздействия была выбрана концентрация 600 мМ NaCl, так как эксперименты показали, что при таком содержании соли все три вида способны выживать при более длительных воздействиях и поддерживать деление. Для исследования солевого воздействия была выбрана кислотность pH=5,3, так как эксперименты показали, что при такой кислотности все три вида способны выживать при более длительных воздействиях и поддерживать деление .

3.3 Химические реактивы

Пируват натрия 100 мг/мл (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA); D-фруктозофосфат динатриевая соль гидрат (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA);

фосфо(енол) пируват натриевая соль гидрат (97% enzymatic, Sigma-Aldrich St .

Louis, MO, USA); D-рибозо-5-фосфат динатриевая соль дегидрат (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA); DL-глицеральдегид-3-фрсфат раствор 46.1 мг/мл (SigmaAldrich St. Louis, MO, USA); Очищенные ( 98%) аминокислоты (все незаменимые аминокислоты) и нуклеоти(зи)ды (аденозин, дезоксиаденозин, инозин, цитозин монофосфат, тимидин) получены от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA); ацетат аммония (Ultra Pure Grade, Хеликон, Москва, Россия); муравьиная кислота (98Riedel-de Haen, GmbH, Germany); раствор гидроксида аммония (29.73% from Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA); метанол (Absolute HPLC, Biosolve, Valkerland, The Netherlands), вода (HPLC-gradient grade PAI, Panreac, Barcelona, Spain), ацетонитрил (HPLC-Hypergradient grade, Panreac, Barcelona, Spain) .

3.4 Экстракция метаболитов

Для анализа метаболома бактерий было проведено мгновенное тушение метаболизма с одновременной экстракцией метаболитов охлажденным метанолом из клеток М. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum, выращенных в жидкой среде до логарифмической фазы роста .

Алгоритм метода выделения метаболитов разработан на основе стандартного протокола выделения с использованием холодной метанольной экстракции [59] .

Протокол экстракции метаболитов:

Клеточную культуру в логарифмической фазе роста, объемом 50 мл, центрифугировали в течение 15 мин, на скорости 16000 g при 20 С и удаляли супернатант.

Для отмывки от среды осадок промывали 3 мл 150 мM NaCl дважды:

ресуспендировали клетки, центрифугировали и удаляли супернатант .

Кислотность промывочного раствора регулировали с помощью Трис и HCl, причем для анализа метаболома клеток культивированных в оптимальных условиях кислотность промывочного раствора подбиралась в соответствии со значением pH в логарифмической фазе роста бактерий (pH=6,5). Для промывки клеток молликут подвергнутых кислотному воздействию использовали 150 мМ раствор NaCl с кислотностью pH=5,3. Для промывки клеток молликут подвергнутых осмотическому воздействию использовали 600 мМ раствор NaCl при pH= 6,5. Промытый осадок ресуспендировали в 100 мкл промывочного раствора и экстрагировали метаболиты добавлением 1000 мкл метанола охлажденного при -77 С; тщательно встряхивали (1 мин); выдерживали при температуре -77 С в течение 15 мин, размораживали образец в течение 3 мин при комнатной температуре и ещё раз встряхивали. Центрифугировали полученный экстракт в течение 30 мин при скорости 16000 g при 4 С. Супернатант отбирали и высушивали с использованием вакуумного испарителя (Labconco, Kansas City, USA). Сухой экстракт хранили при температуре -77 С не более 5-х суток перед анализом. Непосредственно перед анализом экстракт растворяли в 20% водном растворе ацетонитрила .

–  –  –

Детектирование метаболитов проводилось использованием c времяпролетного масс-спектрометра Q-TОF серии 6520 (Agilent Technologies, U.S.). Поток с аналитической колонки вводился Santa Clara, California, непосредственно в электрораспылительный ионный источник (ESI) массспектрометра. Перед анализом масс-спектрометр калибровался с точностью 2 ppm от m/z. Напряжение ионизирующего спрея 3500 В как в положительном, так и в отрицательном режимах съемки. В качестве осушающего газа при давлении 20 psi и газа, подаваемого в ячейку столкновений, был использован азот. Температура кварцевого капилляра составляла 325 C .

ВЭЖХ разделение метаболитов поводилось с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent серии 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, U.S.), соединенного с масс-спектрометром .

Для разделения метаболитов методом гидрофильной хроматографии была использована аналитическая колонка на основе немодифицированного силикагеля Zorbax RX-SIL Narrow-Bore (Agilent Technologies, Santa Clara, California, U.S.) 150 мм х 2,1 мм, 5 мкм. Для защиты аналитических колонок от соединений, способных необратимо модифицировать хроматографическую фазу, были использованы предохранительные картриджи Zorbаx RX-SIL analytical guard column (Agilent Technologies, Santa Clara, California, U.S.) 4.6 мм х 12.5 мм, 5 мкм .

Хроматографические условия анализа: температура автоинжектора 8С, температура аналитической колонки 18С, инжектируемый объем образца 2 мкл, поток растворителя 50 мкл/мин. Используемые элюирующие растворы: элюент A

- 20 мM ацетат аммония/0.25 мM гидроксид аммония, в растворителе вода:ацетонитрил 95:5, pH 8.0; элюент B - ацетонитрил. Градиент перехода растворителей: в положительном и отрицательном режимах съемки - 0 мин, 100% B; 30 мин, 0% B; 32 мин, 0% B; 35 мин, 100% B; 60 мин, 100% B .

Подтверждение идентификации метаболитов проводилась с помощью получения спектров фрагментации детектированных ионов. Использовалась фиксированная энергия столкновения 20 эВ, спектры фрагментации снимались в диапазоне 30-1000 m/z c минимальным окном изолирования иона шириной 1,3 m/z. Полученные спектры фрагментации сравнивались со стандартными спектрами, полученными для тех же условий анализа и хранящиеся в базе данных Metlin [176] .

3.6 Идентификация метаболитов и программное обеспечение

Идентификация метаболитов проводились с помощью программного обеспечения Metabolomic Analysis and Visualization Engine (MAVEN) [177] и интернет ресурса Trans-Proteomic Pipeline (TPP), где полученные данные конвертировались в формат «mzXML» (формат, совместимый с программой MAVEN) .

Идентификация метаболитов M. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum проводилась с использованием базы данных внутриклеточных метаболитов. Такая база данных составлена на основе метаболической реконструкции и представляет собой объединение всех теоретически возможных метаболитов M. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum [23, 174, 178]. Для идентификации метаболитов были использованы следующие параметры: интервал значений m/z (окно экстракции) +/- 10 ppm m/z; минимальная интенсивность пика - 1000 условных единиц;

минимальное значения отношения интенсивностей сигнал/базовая линия – 5 [179] .

–  –  –

Попарное сравнение масс-спектрометрических метаболомных данных трех видов молликут между собой, а также сравнение метаболомов клеток одного вида, культивированных в оптимальных условиях и в условиях воздействия (кислотное и осмотическое) проводили с использованием онлайн сервиса XCMS [5]. Сервис XCMS включает предварительную обработку данных массспектрометрического анализа метаболитов, в том числе, этапы обнаружения массспектрометрических пиков веществ, фильтрации шумового сигнала в спектрах, нелинейной коррекции времени выхода веществ, сопоставления интегральных ионных интенсивностей сигнала между разными образцами и группами сравнения, обнаружение статистически достоверных отличий в двух группах данных и визуализацию результатов .

Для выделения масс-спектрометрических пиков, соответствующих ионам аналитов, в сервисе XCMS суммарный трехмерный (m/z, интенсивность, время удерживания) спектр делится на слои с интервалом 0.1 m/z, и каждый слой обрабатывается с учетом временных хроматографических характеристик и интенсивности сигнала в каждой точке хроматограммы. Определяется максимальное значение МС-сигнала в слое и временные границы изменения сигнала в одном слое. Обнаружение временных границ хроматографических пиков проводится с использованием второй производной функции Гаусса в качестве модели. Далее анализ данных сервисом XCMS включает этап отбора пиков аналитов по соотношению сигнал-шум. Рекомендованное наиболее эффективное значение соотношения сигнал/шум для отбора -10 [5] .

После обнаружения сигналов аналитов в спектрах индивидуальных образцов данные соотносятся между разными образцами в группе повторов. Для коррекции времени выхода веществ используется сигнал анализируемого вещества с максимальной интенсивностью среди всех образцов. Коррекция времени выхода проводится с помощью отбора из выделенных ранее сигналов группы пиков, стабильно детектируемых во всех образцах. Такие сигналы используются в качестве временных стандартов. Алгоритм вычисляет среднее время удерживания вещества для каждой группы и отклонение от среднего времени для каждого образца в одной группе. На основе этих данных строится профиль отклонений времени удерживания. Полученный профиль отклонений используется для нелинейной коррекции времени удерживания исходных данных .

Далее проводится вычисление характеристики сигналов (интегральная интенсивность пика), с использованием которой проводиться дальнейший статистический анализ данных. Для определения сигналов метаболитов, интегральная интенсивность которых значительно отличается в группах сравнения (например, контроль и опыт), проводился статистический анализ с использованием t-теста Уэлча (t-тест Уэлча позволяет учесть отличия в дисперсиях двух групп); отличия в метаболомах ранжировались по уровню значимости. Отличия в интегральной интенсивности сигналов между двумя группами МС-данных считались достоверными при уровне значимости (рзначение) не более 0,05. Следует отметить, что при обработке данных с помощью сервиса XCMS не поводилось нормализации интенсивности пиков, поэтому мы провели дополнительную количественную оценку изменения интегральной интенсивности сигналов, соответствующих значимым отличиям, с помощью нормализации площади хроматографического пика на суммарный ионный ток .

Заключительным этапом анализа метаболома с помощью сервиса XCMS является визуализация результатов .

3.8 Выравнивание аминокислотных последовательностей

В соответствии с результатами анализа метаболомных данных были выбраны ферменты, для которых был проведен поиск аминокислотных замен в активных центрах. Мы сравнили последовательности активных центров выбранных ферментов у S. melliferum, М. gallisepticum, А. laidlawii, используя последовательности их гомологов в клетках E.coli и B. subtilis в качестве эталона при помощи алгоритма ClustalW, доступного на онлайн-ресурсе http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. Мы использовали гомологичные белки из других организмов, если кристаллические структуры ферментов E. coli или B .

subtilis не определены. Для анализа аминокислотных замен в активных центрах анализируемых белков мы использовали базу данных PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) .

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Анализ метаболома бактерий A. laidlawii, S. melliferum и M. gallisepticum Разработанный нами алгоритм анализа метаболома микоплазм включал следующие шаги: реконструкция карт метаболизма и составление списков возможных внутриклеточных метаболитов; анализ и детектирование метаболитов с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС; обработка данных и интерпретация результатов .

Реконструкция метаболизма обеспечивает платформу для визуализации и анализа метаболомных данных. Мы выбрали наиболее информативный алгоритм реконструкции, заключающийся в построении схемы на основе первичной аннотации и последующем уточнении ферментативных реакций вручную .

Полученная реконструкция позволяет составить списки возможных внутриклеточных метаболитов для обработки результатов анализа метаболома и визуализировать результаты метаболомного анализа для выявления механизмов регуляции в клетке. В результате обработки данных, полученных при анализе метаболома, мы получили список детектированных пиков. Каждому пику соответствует значение m/z иона вещества, которое мы сопоставили с соответствующими теоретическими значениями m/z метаболитов - провели идентификацию МС-пиков. Для идентификации пиков в спектре мы составили базу данных, которая содержит информацию о структуре веществ, точную массу молекулы и идентификационный номер для каждого метаболита. Для интерпретации визуализации полученных данных мы использовали реконструированные схемы метаболизма, позволяющие увидеть метаболические пути, их взаимосвязь и ферменты, катализирующие реакции. Также мы использовали базы данных и содержащие подробную KEGG EcoCyc, информацию о каждом элементе метаболического пути, включая точную массу метаболита и его структуру [180]. Для визуализации полученных данных мы нанесли детектированные метаболиты на реконструкцию метаболома, что позволило увидеть каскады изменений и их взаимосвязь и сопоставить метаболомные результаты с различиями в репертуаре ферментов .

4.2 Реконструкция метаболизма S. melliferum, M. gallisepticum и A.laidlawii Реконструкция метаболизма позволяет визуализировать данные метаболомного анализа и составить списки метаболитов, входящих в состав клеток исследуемых видов молликут. В нашей работе был выбран алгоритм реконструкции, заключающийся в построении схемы метаболизма на основе первичной протеогеномной аннотации и последующего уточнения наличия ферментативных реакций в схеме [45]. Для того, чтобы построить первичную метаболическую карту в соответствии с аннотированными ферментами для каждого вида, мы сопоставили результаты протеогеномной аннотации трех исследуемых видов, опубликованные в базе данных UniprotKB [23, 175, 181] с общими метаболическими схемами из базы данных Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [180]. Затем была составлена общая схема метаболизма для трех видов и проведено уточнение первичной реконструкции. Уточнение схемы метаболизма включает удаление реакций, которые не являются частью метаболических путей и приводят к образованию «мертвых концов»; поиск «пробелов» в метаболических путях; поиск аннотированных ферментов, способных катализировать реакции, соответствующие пробелам в схеме;

проверку возможности утилизации или выведения всех конечных продуктов в клетке. Конечный результат представляет собой карты метаболизма трех видов молликут без «пробелов», изолированных реакций, или неполных метаболических циклов (см. рисунок 4-6). Полученные схемы метаболизма были дополнены с учетом данных метаболомного анализа .

Рисунок 4. Реконструкция схемы метаболизма M .

gallisepticum S6. Метаболиты отмечены кружками, ферменты, катализирующие реакции, отмечены ромбами, метаболиты, детектированные в наших экспериментах, отмечены зеленым цветом .

Рисунок 5. Реконструкция схемы метаболизма А .

laidlawii PG-8A. Метаболиты отмечены кружками, ферменты, катализирующие реакции, отмечены ромбами, метаболиты, детектированные в наших экспериментах, отмечены зеленым цветом .

Рисунок 6. Реконструкция схемы метаболизма S .

melliferum KC3. Метаболиты отмечены кружками, ферменты, катализирующие реакции, отмечены ромбами, метаболиты, детектированные в наших экспериментах, отмечены зеленым цветом .

4.2.1 Удаление реакций из первичной схемы метаболизма Аннотация Mycoplasma gallisepticum (в отличие от Acholeplasma laidlawii и содержит специфический транспортный белок, Spiroplasma melliferum) ответственный за перенос маннитола в клетку (домен IIB маннитол-специфичного транспортного белка MtlA, MGA_1283), в то время как белок маннитол-1-фосфатдегидрогеназа, который катализирует следующую реакцию потребления маннитол-1-фосфата, в аннотации отсутствует. Мы предположили, что MGA_1283 не участвует в транспорте маннитола. Среди аннотированных белков и мы обнаружили белок M. gallisepticum, A. laidlawii S. melliferum фосфоманномутазу (MGA_0358, SPM_05262, ACL_0849|pmm), катализирующий изомеризацию маннозо-6-фосфата в маннозо-1-фосфат [23, 175, 182]. Маннозо-1фосфат является субстратом для синтеза ГДФ-маннозы. ГДФ-манноза является ключевым субстратом в формировании гликопротеинов в клетках эукариот в пути активации синтеза гликоконъюгатов, так как используется прямо или косвенно в качестве донора маннозы для всех маннозоассоциированных реакций. В клетках прокариот манноза, как правило, утилизируется в качестве источника углерода, а путь синтеза ГДФ-маннозы из маннозо-1-фосфата не аннотирован не только для молликут, но и для многих других видов бактерий, например, Bacillus subtilis. Мы удалили из схемы метаболизма реакцию изомеризации маннозо-6-фосфата, так как она приводит к образованию, так называемого, «мертвого конца» в метаболической реконструкции (то есть участвует в образовании метаболита, который не может быть утилизирован ни в одной другой реакции или выведен из клетки). Мы также заметили, что у вида близкого исследуемым трем видам молликут, M. pneumoniae, соответствующий ген, deoB (C985_0069) аннотирован как ответственный за белок фосфопентомутазу (Рpm), отсутствующий в схеме метаболизма M. gallisepticum и S. melliferum [182, 183]. Мы переаннотировали фосфоманномутазу как фосфопентомутазу и определили, что этот фермент катализирует реакцию перехода из 2-деокси-D-рибозо-1-фосфата в 2-деокси-Dрибозо-5-фосфат в клетках M. gallisepticum и S. melliferum .

4.2.2 Реакции, приводящие к образованию «мертвых концов» в схеме метаболизма Потребление маннозы у молликут состоит из последовательных реакций, включающих перенос маннозы в клетку сопряженный с фосфорилированием до маннозо-6-фосфата (специфичный транспорт маннозы). Затем маннозо-6-фосфат изомеризуется до фруктозо-6-фосфата с помощью фермента изомеразы, а фруктозо-6-фосфат фосфорилируется до фруктозо-1,6-бифосфата с использованием АТФ (с помощью белка фруктозо-6-фосфат-киназы) и встраивается в реакции гликолиза. У M. gallisepticum и S. melliferum аннотированы все рассмотренные ферменты пути использования маннозы, кроме транспортных белков. Однако экспериментально показано, что M. gallisepticum может потреблять маннозу в качестве единственного источника энергии [184] .

Такие данные указывают на присутствие фермента, способного транспортировать маннозу в клетки M. gallisepticum. Мы предполагаем что у M. gallisepticum и S .

melliferum фермент FruA, являющийся пермеазой, катализирует перенос маннозы, так как такая активность FruA продемонстрирована для других бактерий [185] (см. рисунок 7) .

Рисунок 7. Пример решения проблем образования «мертвых концов» при реконструкции метаболизма молликут .

Метаболизм маннозы. Кружками обозначены метаболиты, прямоугольниками - ферменты, катализирующие реакции .

–  –  –

Активный транспорт фруктозы в клетки молликут ранее продемонстрирован в экспериментах с соединениями, меченными изотопом углерода С13 [184]. Такие эксперименты предполагают добавку вещества, меченного изотопом, в питательную среду (чаще всего это глюкоза-С13), анализ метаболома МС-методами и поиск продуктов превращения меченного вещества в метаболоме. В клетках молликут фруктозо-1-фосфат (продукт транспорта фруктозы в клетку с помощью специфичного для фруктозы транспортного фермента) может быть разложен на глицерон-фосфат (дигидроксиацетонфосфат) и глицеральдегид ферментом фруктозодифосфат-альдолазой. Первый продукт разложения дигидроксиацетонфосфат - немедленно используется в реакциях гликолиза и других биохимических превращениях. Второй продукт глицеральдегид - преобразуется ферментом алкогольдегидрогеназой в глицерин и затем может быть вовлечен в синтез гицеролипидов (см. рисунок 4-6). Фермент алкогольдегидрогеназа аннотированн в геноме A. laidlawii и S. melliferum, но не аннотирован для М. gallisepticum (SPM_04497, ACL_0177, ACL_0420) [23, 175, 182]. Кроме того, фруктозо-1-фосфат может быть фосфорилирован до фруктозобисфосфат ферментом 1-фосфофруктокиназой, аннотированной для S .

melliferum (SPM_01070). Исходя из того, что фруктоза активно потребляется клетками М. gallisepticum и ферменты пути метаболизма фруктозы аннотированы для родственных видов A. laidlawii, S. melliferum и M. pneumoniae [3, 23, 175], мы отметили превращения, катализируемые ферментами алкогольдегидрогеназа и 1фосфофруктокиназа на метаболической карте М. gallisepticum (см. рисунок 3) .

Переход нуклеотидов дУТФ/дУДФ в клетках молликут катализируется уридинкиназой (MGA_0106, в процессе ACL_1139, SPM_05627), фосфорилирования уридина. В метаболизме пуринов и пиримидинов М .

gallisepticum отсутствуют некоторые ферменты, которые катализируют реакции перехода ИМФ в ИТФ, дефосфорилирования монофосфатов пуриновых нуклеотидов, ферменты изомеризации фосфорибозы и др. (например: deoA, deoB surE/ushA, dITP/XTP пирофосфатаза), хотя они были аннотированы для S .

melliferum и A. laidlawii [23, 175]. Данные нашего исследования метаболома указывают на наличие продуктов реакций, катализируемых подобными ферментами, в метаболоме М. gallisepticum. Активность этих ферментов очевидна, поэтому мы нанесли перечисленные белки на схеме метаболизма М .

gallisepticum (см. рисунок 4) .

4.2.4 Выявленные особенности метаболизма молликут

Построение метаболических карт для исследуемых трех видов молликут позволило выявить множество незавершенных путей, с ферментативными «пробелами». Для путей, в которых только один фермент целого пути отсутствует, разрыв может быть заполнен путем добавления реакции в схему, как сделано ранее при реконструкции метаболизма другой микоплазмы M .

альтернативный путь решения проблемы разрыва в pneumoniae [3];

метаболическом пути анализ дополнительных активностей известных ферментов, способных заполнить такой пробел .

У исследуемых нами видов молликут имеются специфические особенности в метаболизме пуринов и пиримидинов (рис. 4-6). В метаболизме пуриновых нуклеотидов всех молликут возможен синтез нуклеотидов напрямую из азотистых оснований, однако последовательное расщепление нуклеотидов в разных видах происходит не одинаково. Прямое превращение пуринового азотистого основания в мононуклеотид катализируется ферментом AMФ-пирофосфорилазой, которая аннотирована для трех исследуемых видов [23, 175]. Обратное последовательное расщепление нуклеотида до азотистого основания через нуклеозид выполняется белками 5'-нуклеотидазой и нуклеозид-фосфорилазой. Фермент 5'-нуклеотидаза позволяет дефосфорилировать AMФ и использовать его в качестве источника энергии. А рибоза, полученная из AMФ, может служить источником энергии благодаря вовлечению ее в пентозофосфатный путь. Белок 5'-нуклеотидаза, катализирующий реакцию перехода АМФ в аденозин, не аннотированн в геноме S. melliferum в отличие от А. laidlawii и М. gallisepticum (следует отметить, что аннотация М. gallisepticum содержит белок тимидинкиназу, способный выполнять функции 5'-нуклеотидазы). Однако мы не считаем, что 5'-нуклеотидаза должна быть определена для S. melliferum как было предложено для M. pneumoniae [3] .

Мы предполагаем, что метаболизм пуринов в S. melliferum смещен в сторону образования нуклеотидов и синтеза ДНК и РНК, и что клетки S. melliferum не используют нуклеотиды в качестве источника рибозы [186] .

Другой особенностью метаболизма молликут является образование глицерона (дигидроксиацетона) - метаболита, который (см. рисунок 4-6) возникает спонтанно при гидролизе дигидроксиацетона фосфата до того, как дигидроксиацетонфосфат будет изомеризован в глицеральдегид-3-фосфат и примет участие в реакциях гликолитического пути. Нефосфорилированный дигидроксиацетон является чрезвычайно токсичным для клетки соединением, так как он реакционно-активен и способен вызывать мутации при взаимодействии с ДНК [3, 187]. Глицерон обычно дезактивируется преобразованием в глицерин с помощью глицериндегидрогеназы, однако этот фермент не аннотирован в молликутах. В аннотации исследуемых трех видов присутствует только фермент дигидроксиацетон-киназа, способный катализировать обратный переход глицерона в исходную нетоксичную форму - глицерон-фосфат .

4.3 Пентозофосфатный путь в клетках молликут

Одной из самых важных особенностей метаболизма молликут является отсутствие важнейшего фермента - трансальдолазы в пентозофосфатном метаболическом пути. Пентозофосфатный путь или гексозомонофосфатный шунт

- связующее звено между пентозами и гексозами, единственный способ получения рибоз для синтеза нуклеотидов. Также пентозофосфатный путь выполняет функцию вовлечения пентоз в метаболизм глюкозы. Этот путь представлен в метаболизме всех живых организмов и состоит из окислительной и восстановительной стадий. Во многих организмах, включая микоплазмы, представлена только его неокислительная стадия. В этой части пентозофосфатного пути участвуют два фермента - транскетолаза (tktA) и трансальдолаза (tal) (рисунок 8). Транскетолаза катализирует перенос двух углеродных единиц и превращает две пентозы, ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5фосфат, в седогептулозо-7-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат (в направлении вовлечения рибоз в гликолиз). Тот же фермент использует эритрозо-4-фосфат и ксилозо-5-фосфат для того, чтобы получить в результате переноса углеродных фрагментов фруктозо-6-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат, которые далее встраиваются в гликолиз и другие пути. Второй ключевой фермент пути трансальдолаза - связывает эти две транскетолазные реакции. Она удаляет трехуглеродный фрагмент от седогептулозо-7-фосфата и конденсирует его с глицеральдегид-3-фосфатом, формируя фруктозо-6-фосфат и эритрозо-4-фосфат [188]. Аннотация генома показывает отсутствие трансальдолазы у молликут, что, очевидно, создает разрыв в метаболическом пути. Тем не менее, мы обнаружили в метаболоме клеток всех трех изученных видов молликут (наряду с менее специфическими промежуточными соединениями) уникальный промежуточный продукт реакции, катализируемой транскетолазой - седогептулозо-7-фосфат .

Такие данные указывают на то, что пентозофосфатный путь функционально активен в трех исследуемых видах. Кроме того, наличие потока метаболитов от гликолиза к функциональному пентозофосфатному пути было ранее продемонстрировано для близкого родственника исследуемых видов M .

pneumoniaе (13C-6-меченные атомы молекулы глюкозы из питательной среды встраивались в метаболизм и были обнаружены в составе молекулы рибозо-5фосфата с помощью масс-спектрометрии) [3] .

Несмотря на полученные экспериментальные данные, поиск по базам данных белков гомологов трансальдолазы во всех геномах молликут дает отрицательный результат. Чтобы заполнить пробел пентозофосфатного пути, можно предположить наличие трансальдолазной активности у неизвестного белка. Еще один способ описать этот феномен микоплазм - найти обходную ветвь пути с использованием дополнительной активности известных ферментов. В литературе показано, что 6-фосфофруктокиназа может связываться с метаболитом седогептулозо-7-фосфат, а фермент фруктозо-бисфосфат-альдолаза может соединиться с седогептулозо-1,7-бисфосфат и разлагать его на глицеронфосфат и эритрозо-4-фосфат (см. рис. 8) [189]. Глицерон-фосфат может быть легко изомеризован до глицеральдегид-3-фосфата с помощью изомеразы и затем встраивается в реакции гликолиза и другие биохимические превращения, а эритрозо-4-фосфат участвует в превращении, катализируемом транскетолазой [188] .

Рисунок 8. Неокислительная стадия пентозофосфатного пути с альтернативными реакциями молликут .

Метаболиты отмечены кружками, ферменты, катализирующие реакции отмечены ромбами, метаболиты, предполагаемые реакции в пути отмечены зелеными стрелками, а отсутствующая реакция красным цветом .

Предложенные изменения в пентозофосфатном пути дают возможность объяснить, как молликуты используют рибозу в качестве источника энергии, несмотря на отсутствие трансальдолазы. Описанный путь активен и в обратном направлении в клетках S. melliferum и А. laidlawii за счет дополнительной функции аннотированных ферментов. Первая реакция - фосфорилирование седогептулозо-7-фосфата - катализируемая 6-фосфофруктокиназой, является необратимой. Однако дефосфорилирование седогептулозо-1,7-бисфосфата может быть обеспечено ферментом фруктозо-1,6-бисфосфатазой [190], аннотированным в геноме Фермент фруктозо-1,6-бисфосфатаза не S. melliferum [175] .

аннотированн для бактерии А. laidlawii, поэтому фосфат эритрозы, образующийся в результате действия транскетолазы из фруктозо-6-фосфата и глицеральдегид-3фосфата, должен быть вовлечен в какую-либо другую реакцию. Эритрозо-4фосфат может быть использован в синтезе аминокислоты фенилаланин, так как все ферменты биосинтеза фенилаланина аннотированы для А. laidlawii [23]. В клетках М. gallisepticum экспериментально показано отсутствие фруктозо-1,6бисфосфатазы, а также отсутствие трансальдолазной активности [5]. Поэтому мы можем только предположить, что полученный метаболит эритрозо-4-фосфат в М .

gallisepticum перерабатывается ферментом D-фруктозо-6-фосфат-D-эритрозо-4фосфат-лиазой, который не аннотированный для М. gallisepticum, но для других видов микоплазм аннотирован (например, для М. fermentans M64). Мы считаем, что эта активность должна быть определена для М. gallisepticum и является способом реализации неокислительной ветви пентозофосфатного пути для М .

gallisepticum .

4.4 Составление списков возможных внутриклеточных метаболитов исследуемых видов молликут Для каждого из трех видов бактерий - М. gallisepticum, A. laidlawii и S .

melliferum - был составлен список предсказанных внутриклеточных метаболитов на основе данных реконструкции метаболизма и протеогеномной аннотации .

Список внутриклеточных метаболитов включает в себя все соединения, которые служат в качестве субстратов и продуктов реакций, катализируемых аннотированными ферментами. Списки метаболитов, предсказанных с помощью данных протеогеномной аннотации, состоят из 323 метаболитов для A. laidlawii, 225 метаболитов для М. gallisepticum и 361 - для S. melliferum. На основе полученных списков была создана объединенная база данных метаболитов, необходимая для идентификации веществ в масс-спектрах в соответствии с точным значением m/z. Объединенный список метаболитов трех видов состоит из 500 соединений. Идентификация метаболитов проводилась с помощью программы Maven по составленной базе данных. Такая база данных подходит для анализа каждого вида, а также позволяет обнаружить метаболиты, производимые неохарактеризованными ферментами, так как объединяет в себе данные для трех видов с различающимся метаболизмом .

4.5 Детектирование метаболитов трех видов молликут с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС Метаболиты для анализа выделяли из клеток М. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum, находящихся в логарифмической фазе роста. Фаза роста бактерий определялась исходя из времени удвоения числа клеток (см. рисунок 9) и pH среды для A. laidlawii и S. melliferum (см. «Штамм бактерий и условия культивирования») [191] .

Для мгновенного тушения метаболизма и одновременной экстракции метаболитов был использован метод выделения метаболитов охлажденным метанолом [59]. Высокая эффективность этого метода и низкие потери метаболитов в процессе такой обработки клеток были продемонстрированы во многих публикациях [59, 61, 192]. Обнаружение метаболитов проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с времяпролетной масс-спектрометрией и ионизацией методом электрораспыления. Параметры хроматографического метода, а также параметры записи спектра были оптимизированы с использованием внешних стандартов для получения наиболее достоверных данных (варьировались такие параметры, как поток элюента, градиент растворителей, температура и напряжение при электрораспылении, интенсивность потока осушающего газа и энергия столкновения при фрагментации, см. «Инструменты и параметры ВЭЖХ») .

Идентификация метаболитов подтверждалась с помощью фрагментации обнаруженных родительских ионов методом таргетной масс-спектрометрии [3] .

Рисунок 9. Определение кинетики роста М .

gallisepticum в жидкой культуральной среде .

Красная кривая представляет накопление рибосомальной РНК, синяя кривая - ДНК .

Горизонтальная ось показывает время в часах и вертикальная ось - относительное количество РНК или ДНК в логарифмической шкале (log2) [191] .

Измерение метаболитов было проведено для семи биологических повторов для каждого из трех исследуемых видов. Обычно за один ЖХ-МС анализ идентифицировалось около 120 пиков, со значениями m/z близкими к точным значениям m/z метаболитов (отклонение менее 10 ppm от теоретического значения m/z) .

Спектры фрагментации были получены для большинства обнаруженных метаболитов (таблица 2). Полученные спектры фрагментации автоматически сравнивались с помощью программы Metlin MS/MS Spectrum match со стандартными спектрами (http://metlin.scripps.edu/spec_search.php) фрагментации, которые были получены в аналогичных условиях (учитывались полярность ионизации и значение энергии столкновения) .

Таблица 2. Результаты анализа спектров фрагментации ионов S .

melliferum, M .

gallisepticum и A. laidlawii и m/z фрагментов в стандартных спектрах, полученных в схожих условиях анализа и представленных в базе данных Metlin (энергия соударения 20 эВ) [155] .

–  –  –

Оценка схожести полученного спектра фрагментации со стандартным спектром фрагментации проводилась на основании алгоритма Metlin MS/MS учитывающего соответствие масс и относительной Spectrum match, интенсивности ионов фрагментов в спектрах [155, 176, 193]. Вещество считалось однозначно идентифицированным при значении коэффициента соответствия спектров фрагментации более 70%. На рисунке 10 продемонстрирован пример подтверждения идентификации урацила примеры (дополнительные подтверждения идентификации ионов представлены в приложении 1, рисунок П3). Все спектры фрагментации подтвердили первичную идентификацию соединений на основе точного значения m/z. Большинство измеренных значений m/z не отклонялись от теоретического значения более чем на 10 ppm. Среди обнаруженных метаболитов было несколько соединений, пики которых демонстрировали относительно большое отклонение от теоретических значений m/z ионов (до 20 ppm m/z). Тем не менее, спектры фрагментации позволили однозначно идентифицировать такие соединения по наличию уникальных фрагментов в спектре фрагментации (например, NAD) .

Рисунок 10. Пример сопоставления спектра фрагментации урацила, полученного при анализе метаболома S. melliferum (выше оси абсцисс) со стандартным спектром, полученным в тех же условиях (энергия соударения 20 эВ, режим съемки положительный, родительский ион M+H, m/z=113.03) и представленным в базе данных Metlin [155] ( ниже оси абсцисс) .

4.6 Идентификация метаболитов бактерий A. laidlawii, S. melliferum и M .

gallisepticum С помощью метода ЖХ-МС с использованием HILIC хроматографии мы детектировали 75, 74 и 74 метаболита в клетках А. laidlawii, М. gallisepticum, S .

соответственно. Полученные результаты были нанесены на melliferum реконструированные карты метаболизма А. laidlawii, М. gallisepticum, S .

(рисунок 4-6). Общими детектированными для трех видов melliferum метаболитами являются 50 соединений, среди которых компоненты метаболизма пуринов и пиримидинов, аминокислот, никотинамида и никотината, КоА биосинтеза, пентозофосфатного пути и др. (см. рисунок 11) .

Всего было обнаружено от 20 до 33% от списка всех предсказанных метаболитов для каждого вида. Проведение максимально полного анализа метаболома ограничено несколькими причинами. Некоторые метаболиты не могут быть обнаружены методом ЖХ-МС, так как они нестабильны в условиях ионизации при электрораспылении, или в результате потерь во время пробоподготовки, включающей отмывку клеток и экстракцию метанолом [61] .

Часть метаболитов являются трудно детектируемыми в связи с большой скоростью протекания реакций с их участием, например, компоненты гликолиза .

В проведенных экспериментах мы обнаружили несколько промежуточных соединений гликолиза (фосфо-D-глицерат, фосфоенолпируват, глицеральдегид-3фосфат, -D-фруктозо-1,6-бисфосфат), из чего можно заключить, что, по крайней мере, скорость протекания реакций гликолиза значительно снижается за счет обработки охлажденным метанолом. Ранее с использованием подобной процедуры пробоподготовки была продемонстрирована возможность анализа аналогичных компонентов гликолиза в клетках M. pneumoniaе [168] .

Рисунок 11. Диаграммы пересечения множеств детектированных метаболитов для трех видов молликут .

В результате анализа было детектировано 95 различных внутриклеточных соединений, входящих в состав метаболома трех видов молликут (М .

gallisepticum, S. melliferum и А. laidlawii) (см. таблицу 3). Среди метаболитов были детектированы соединения, которые являются продуктами реакций основных метаболических путей, таких как гликолиз, метаболизм аминокислот, сахаров и аминосахаров, синтез терпеноидов, метаболизм пуринов и пиримидинов и др .

Наиболее равномерно и плотно заполнены детектированными соединениями карты метаболизма производных пуриновых и пиримидиновых оснований (см .

рисунок 4-6). Мы обнаружили азотистые основания аденин, тимин, гуанин, ксантин, гипоксантин, урацил, цитозин, их нуклеозиды и дезоксинуклеозиды и некоторые из моно-, ди-, трифосфатных нуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов .

Следует отметить, что мы не рассматривали моно- и динуклеотид инозина, так как в соответствии с данными литературы МС-сигнал от этих соединений можно спутать с сигналами от фрагментов распада АДФ и АМФ в процессе анализа [163]. Активная экспрессия белков, которые функционально связанны с метаболизмом пуринов и пиримидинов, была продемонстрирована в исследованиях протеома и транскриптома молликут [23, 175]. В метаболоме S .

melliferum мы не обнаружили дезоксиуридин, дTДФ, ксантозин-трифосфат, ксантозин, 2-дезоксиинозин-5-фосфата, в то время как эти соединения были обнаружены в метаболоме М. gallisepticum и А. laidlawii. Среди метаболитов М .

gallisepticum и А. laidlawii, мы не смогли детектировать инозин и дТТФ .

Сахара являются самым важным источником энергии для молликут; их транспорт в цитоплазму сопровождается фосфорилированием [175]. Углеводы и их производные (в том числе компоненты гликолиза, см. рисунок 4-6), включая седогептулозо-7-фосфат, D-рибозо-5-фосфат, D-маннитол-1-фосфат/D-сорбитолфосфат, фруктозо-1,6-бисфосфат, 5-фосфо-D-рибозо-1-дифосфат, 3-фосфо-Dглицерат, фосфоенолпируват, н-ацетил-D-галактозамин-6-фосфат/н-ацетил-Dглюкозамин-6-фосфат/н-ацетил-D-маннозамин-6-фосфат были обнаружены в метаболоме всех трех видов молликут. Мы также обнаружили дезокси-D-рибозофосфат в метаболомах М. gallisepticum и A. laidlawii, но пик этого соединения можно спутать с сигналом от распада других метаболитов по данным публикаций [163]. Мы обнаружили н-ацетил-D-галактозамин-6-фосфат и D-фруктозо-1,6бисфосфат в метаболоме A. laidlawii, а 3-фосфо-D-глицерат - в метаболоме М .

gallisepticum. Обнаружение фосфорилированных производных сахаров хорошо согласуется с данными протеогеномной аннотации [23, 175]. Например, транспортер маннитола (MtlA) аннотирован для М. gallisepticum, MGA_1283, а Dманнитол-1-фосфат детектирован в составе метаболома [168] .

Таблица 3. Идентифицированные метаболиты в клетках S .

melliferum, M. gallisepticum и A.laidlawii

–  –  –

Анализ метаболома показал, что клетки микоплазм наряду с фосфопроизводными сахаров содержат также их нефосфорилированные формы. Ранее в литературе встречались предположения, что нефосфорилированные формы углеводов могут попадать из среды или быть адсорбированы на поверхности клетки [21, 194-197]. Стоит отметить, что детектирование нефосфорилированных форм D-фруктозы, D-глюкозы и D-рибозы было ранее продемонстрировано в метаболоме клеток M. pneumoniae [168]. Кроме того, системы белков ABCтранспортеров углеводов, которые не связаны с фосфорилированием, аннотированы для M. gallisepticum и S. melliferum (MGA_1076, MGA_1077, MGA_1078 и SPM_2645). Во всех трех исследуемых бактериях, мы обнаружили нефосфорилированные формы маннитола/сорбитола и,-трегалозы/сахарозы (отличить такие структурные изомеры не удается, так как упомянутые сахара и аминокислоты имеют идентичные спектры фрагментации и близкое время удерживания) .

Мы обнаружили 18 из 20 аминокислот в трех исследуемых видах молликут (не были детектированы аспарагин и аланин). Поскольку в S. melliferum, М .

gallisepticum и A. laidlawii не были аннотированы ферменты синтеза большинства аминокислот [175], мы предположили экзогенную природу их присутствия в метаболоме за счет активного импорта в клетки с помощью пермеаз. В идентичных экспериментах с бактериями Escherichia coli, мы успешно детектировали аланин и аспарагин. Такие данные свидетельствуют о возможности анализа этих аминокислот используемым методом и о низком содержании аспарагина и аланина в метаболоме S. melliferum, М. gallisepticum и A. laidlawii .

Аланин является наиболее распространенной аминокислотой в белках и его отсутствие в метаболоме молликут можно объяснить только его быстрым вовлечением в синтез белка с помощью аминоацил-тРНК синтетазы .

В метаболоме всех трех молликут мы детектировали промежуточные продукты биосинтеза рибофлавинов диаминогидроксифосфорибозиламинопиримидины и сами коферменты флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Среди исследуемых трех видов только аннотация A. laidlawii содержит белки, ответственные за реакции биосинтеза рибофлавина с участием диаминогидроксифосфорибозиламинопиримидинов. Однако в метаболоме S .

melliferum и М. gallisepticum детектирован масс-спектрометрический пик соединения 5-амино-6-(5-фосфорибозиламино)урацил. Детектирование промежуточного соединения биосинтеза ФАД и ФМН свидетельствует об активности этого пути в клетках S. melliferum и М. gallisepticum, несмотря на отсутствие аннотирования ферментов .

4.7 Сравнительный количественный анализ метаболомов трех видов M .

gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum Мы провели сравнительный анализ относительного содержания метаболитов в клетках трех видов M. gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum и выявили отличия в метаболизме этих видов. В первую очередь, отличия касаются метаболизма аминокислот, липидов и углеводов, биосинтеза терпеноидов и рибофлавинов (см. таблицу 4) .

Таблица 4. Парное количественное сравнение метаболитов трех видов молликут (S .

melliferum, M. gallisepticum и A.laidlawii)

–  –  –

Среди компонентов метаболизма липидов мы обнаружили высокое содержание глицерин-3-фосфата (sn-glycerol-3-phosphate) в метаболоме клеток A .

laidlawii и пониженное содержание ЦMФ в метаболоме клеток A. laidlawii по сравнению с S. melliferum и M. gallisepticum (см. таблицу 4). Снижение уровня глицерин-3-фосфата и одновременное повышение содержания ЦМФ указывает на активный синтез фосфатидилглицерина, так как реакция образования фосфатидилглицерофосфата протекает с использованием глицерин-3-фосфата и ЦДФ-диацилглицерола в качестве предшественников и образованием ЦМФ .

Фосфатидилглицерин активирует синтез гликолипидов в клетках А. laidlawii с помощью таких ферментов, как -моногликозил-диацилглицерол-синтазы и дигликозил-диацилглицерол-трансферазы [198]. Таким образом, снижение уровня глицерин-3-фосфата и одновременное повышение содержания ЦМФ свидетельствует об активном синтезе глицерофосфолипидов в клетках А .

laidlawii. Основными компонентами мембраны клеток А. laidlawii являются глико- и фосфогликолипиды (более 50% от массы мембраны), в то время как мембраны всех остальных видов микоплазм преимущественно состоят из фосфатидных липидов [199]. Идентифицированные нами отличия в метаболоме могут быть следствием отличия состава мембраны клеток А. laidlawii от состава мембраны клеток других видов молликут .

Рисунок 12. Биосинтез терпеноидов в клетках молликут. Метаболиты отмечены кружками, ферменты, катализирующие реакции отмечены ромбами, детектированные метаболиты отмечены зеленым. Мевалонатная ветвь биосинтеза терпеноидов («MVA») выделена розовым полем, немевалонатная «MEP/DOXP» ветвь отмечена голубым полем .

Аминокислоты играют важную роль в регуляции состояния клетки. В нашей работе было обнаружено, что в нормальных условиях содержание цитруллина повышено в M. gallisepticum по сравнению с A. laidlawii и S .

melliferum, в то время как содержание аргинина понижено по сравнению с A .

laidlawii; концентрация лизина понижена в клетках А. laidlawii по сравнению с клетками бактерии Цитруллин является промежуточным S. melliferum .

соединением в пути дезаминирования аргинина, необходимого клеткам для поддержания pH и выработки дополнительной энергии в виде АТФ. В процессе реакций этого пути аргинин преобразуется в цитруллин и выделяется аммиак .

Повышение содержания цитруллина с одновременным снижением содержания аргинина указывает на активность пути дезаминирования аргинина в клетках M .

gallisepticum. В метаболизме большинства видов молликут отсутствуют пути деградации аминокислоты лизин. Лизин-декарбоксилаза - единственный белок в клетках А. laidlawii, способный утилизировать лизин. Кроме того, наличие лизиндекарбоксилазы является отличием А. laidlawii от остальных видов молликут. Обнаруженное при сравнении низкое содержание лизина в клетках А .

laidlawii указывает на активность лизиндекарбоксилазы .

Интересные отличия были идентифицированы среди метаболитов, участвующих в биосинтезе терпеноидов. Существует два направления синтеза терпеноидов в живых организмах: мевалонатный путь («MVA») и немевалонатный путь (2-С-метил-D-эритритол-4-фосфат/1-дезокси-D-ксилозо-5фосфатный путь («MEP/DOXP» путь)) (рисунок 12). Оба пути, «MVA» и «MEP/DOXP», являются взаимоисключающими у большинства организмов, однако взаимодействия между этими путями были зарегистрированы в растениях и некоторых видах бактерий [200, 201]. Большинство организмов производят терпеноиды, используя ферменты мевалонатного пути, который приводит к образованию холестерина и каротиноидов. Однако для многочисленных патогенных микроорганизмов, таких как представители группы Enterobacteria, M .

tuberculosis, M. gallisepticum и S. melliferum альтернативный немевалонатный путь или «MEP/DOXP» путь является уникальным источником терпеноидов [201] .

Ферменты, катализирующие реакции мевалонатного пути, представлены в аннотации A. laidlawii [23]. В геномах М. gallisepticum и S. melliferum аннотированы ферменты «MEP/DOXP» пути биосинтеза терпеноидов. Однако у этих организмов путь представлен не полностью и «обрывается» на реакции образования 1-гидрокси-2-метил-2-бутенил-4-дифосфата (рисунок 12) [175] .

Мы обнаружили высокий уровень содержания 2-С-метил-D-эритритол-4фосфата (компонента «MEP/DOXP» пути) в метаболоме A. laidlawii и не детектировали ни одного компонента мевалонатного пути, более характерного для этого вида. В метаболоме М. gallisepticum и S. melliferum мы обнаружили присутствие значительных количеств 2-С-метил-D-эритритол-2,4циклодифосфата (компонента «MEP/DOXP» ветви метаболизма). В клетках S .

melliferum и A. laidlawii - мы также детектировали геранил-геранил-дифосфат (важный предшественник в биосинтезе всех высших терпеноидов и биосинтезе каротиноидов). Обнаружение компонентов этого пути в метаболоме исследуемых бактерий позволяет предположить активность биосинтеза терпеноидов по «MEP/DOXP» ветви в М. gallisepticum и S. melliferum, несмотря на неполную аннотацию ферментов пути .

4.8 Накопление метаболитов относительно компонентов отдельных метаболических путей S. melliferum, M. gallisepticum и A. laidlawii Для понимания различий в регуляции биохимических процессов у S .

melliferum, M. gallisepticum, и A. laidlawii, мы проанализировали относительные концентрации метаболитов, принадлежащих к отдельным метаболическим путям .

Определение стадий метаболических путей, приводящих к накоплению метаболитов, позволяет выявить особенности метаболизма каждого вида. Для определения метаболических максимумов мы разделили реконструированные карты на простые непересекающиеся ветви (модули). Например, метаболизм пуринов (см.

рисунок 13) был разделен на следующие модули:

«PRPP-Adenine- Deoxyadenosine- dAMP- dADP- dATP»

«PRPP-Adenine- Adenosine- AMP- ADP- ATP»

«Hypoxanthine- Inosine- IMP- ITP»

«Hypoxanthine- IMP»

«Xanthine- XMP»

«Xanthine- Xanthosine- XMP-XTP»

«XTP-GMP»

«PRPP-Guanine- Guanosine-GMP-GDP-GTP»

«L-Glutamine-L-Glutamate»

«GDP-dGDP»

«PRPP-Guanine- Deoxyguanosine-dGMP-dGDP-dGTP»

Далее мы сравнили интегральную интенсивность масс-спектрометрических пиков, соответствующих метаболитам в каждом модуле. Таким образом, мы идентифицировали соединения с максимальным содержанием (узлы) в каждом модуле. В результате было выявлено, что большинство узлов у S. melliferum, M .

gallisepticum, и A. laidlawii представлены одинаковыми метаболитами. Однако в некоторых метаболических путях накапливаются разные метаболиты у трех исследуемых видов. Такие отличия могут указывать на разницу в регуляции биохимических процессов трех видов, имеющих сходные генетические возможности .

В метаболоме A. laidlawii, М. gallisepticum и S. melliferum основные узлы в метаболизме пуринов для всех трех видов представлены азотистыми основаниями, среди которых наиболее высоко представлен аденин. Азотистые основания не могут быть синтезированы в клетках молликут из-за отсутствия ферментов, ответственных за их биосинтез, однако они могут быть транспортированы из питательной среды и использованы в дальнейшем синтезе пуриновых и пиримидиновых производных или накапливаться в результате процессов деградации нуклеотидов. В отличие от M. gallisepticum и A. laidlawii, в клетках S. melliferum наряду с азотистыми основаниями накапливаются нуклеотид-монофосфаты (ГМФ, дГМФ, АМФ) (см. рисунок 13). Накопление нуклеотидов наряду с их предшественниками свидетельствует об активности процессов биосинтеза. Мы предполагаем, что метаболизм пуринов в S. melliferum отличается от метаболизма пуринов M. gallisepticum и A. laidlawii тем, что он направлен в сторону образования нуклеотидмонофосфатов из азотистых оснований .

Рисунок 13. Накопления метаболитов в метаболизме пуринов клеток S. melliferum, M .

gallisepticum, и A. laidlawii. Метаболиты отмечены кружками, ферменты, катализирующие реакции, отмечены ромбами, метаболиты, детектированные в наших экспериментах, отмечены зеленым цветом. Стрелки указывают метаболиты, которые накапливаются в пути. Цвет стрелки соответствует виду бактерий как указано на рисунке. Поле, выделенное цветом, обозначает границы одного модуля, в пределах которого рассматриваются метаболиты .

Мы обнаружили различия в клетках трех видов в метаболизме не только пуринов, но и пиримидинов. В клетках А. laidlawii накапливается тимидин, в S .

melliferum накапливаются дTMФ и дТТФ, а в клетках М. gallisepticum накоплений пиримидинов не определено. Из полученных данных мы предполагаем, что в клетках М. gallisepticum процессы преобразования тимидина и его производных имеют более высокую скорость по сравнению с остальными видами, в клетках S .

melliferum активен синтез тимидиновых нуклеотидов, а в клетках А. laidlawii процессы синтеза пиримидиновых нуклеотидов замедленны .

–  –  –

“- “ - фермент, отвечающий за потребление или производство исследуемого метаболита, по данным метаболомики предположительно может проявлять низкую активность .

Во всех трех видах молликут в модуле синтеза липидов накапливается продукт импорта глицерина в клетки - глицерин-3-фосфат. Глицерин-3-фосфат является предшественником синтеза глицерофосфолипидов - компонентов мембраны клеток. Он может также быть использован в качестве источника углерода с помощью окисления до дигидроксиацетонфосфата (компонента гликолиза, который изомеризуется до глицеральдег-3-фосфата) с помощью глицерин-3-фосфат-дегидрогеназы. Анализ данных показал, что в клетках A .

laidlawii, в отличие от М. gallisepticum и S. melliferum, наряду с глицерин-3фосфатом накапливается дигидроксиацетонфосфат/ D-глицеральдегид-3-фосфат .

Мы предполагаем, что в клетках S. melliferum и М. gallisepticum лимитированы процессы утилизации глицерин-3-фосфата, тогда как клетки A. laidlawii демонстрируют активное использование этого вещества в качестве источника углерода .

Особый интерес вызывают накопления метаболитов в катаболизме углеводов, в частности, в реакциях гликолиза и пентозофосфатного пути .

Основными узлами в катаболизме углеводов клеток А. laidlawii являются как компоненты гликолиза, так и метаболиты, образующиеся в процессе протекания реакций пентозофосфатного пути. Тогда как S. melliferum и М. gallisepticum накапливают только D-глицеральдегид-3-фосфат/дигидроксиацетонфосфат важные промежуточные продукты гликолиза. Такие отличия могут свидетельствовать о лимитировании процессов расщепления углеводов в клетках А. laidlawii и замедлении утилизации фосфорибозилпирофосфата - продукта реакций пентозофосфатного пути, источника фосфорибозильной группы в синтезе нуклеотидов. Обнаруженные особенности метаболизма А. laidlawii могут быть связаны с уникальным для молликут наличием в геноме этих бактерий фермента 5’-нуклеотидазы, способного расщеплять нуклеотиды с образованием фосфорибозила. Для отличающихся метаболических максимумов в путях мы также определили ферменты, ответственные за их утилизацию или синтез (см .

таблицу 5) для проведения исследования влияния аминокислотных замен на активность фермента .

4.9 Влияние аминокислотных замен на активность ферментов

Накопление метаболитов свидетельствует об измененной по отношению к двум другим видам молликут скорости протекания реакций. Мы предположили, что причиной таких изменений могут служить аминокислотные замены в активных центрах ферментов. Мы рассмотрели первичную структуру активных центров ферментов, ответственных за синтез или утилизацию метаболитов, соответствующих отличающимся максимумам (см. Приложение 2). Для того чтобы найти среди всех замен те, которые могут влиять на активность фермента, мы сопоставили данные о накоплении метаболитов с наличием аминокислотных замен в последовательностях активных центров соответствующих ферментов трех видов молликут. Известно, что аминокислотные замены в активном центре обычно приводят к снижению эффективности связывания фермента с субстратом и, как результат, к снижению скорости протекания реакции и накоплению субстрата. Результаты наших исследований показывают, что некоторые аминокислотные замены в активном центре могут привести к увеличению ферментативной активности белка .

Мы определили аминокислотные последовательности активных центров выбранных ферментов, у S. melliferum, М. gallisepticum, А. laidlawii в соответствии выравниванием их с последовательностями активных центров гомологов у E.coli и B. subtilis (см п. «Выравнивание последовательностей»). Активные центры ферментов определялись в соответствии с имеющимися в литературе данными о кристаллической структуре фермента. Мы не обнаружили аминокислотных замен в активных центрах следующих ферментов: пуриннуклеозид-фосфорилаза DeoDтипа, фосфоацилтрансфераза PlsX, енолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH, gap), транскетолаза (Q7NC51_MYCGA одной из двух представленных транскетолаз) (см. Приложение 2) .

Мы не смогли провести поиск аминокислотных замен для глицерин-3фосфат-ацилтрансферазы, так как последовательность ее активного центра не известна. Мы также не смогли сделать выводы об активности транскетолазы Q7NAR4_MYCGA в M. gallisepticum (одной из двух транскетолаз, которые аннотированы для этого вида), так как все аминокислоты в активном центре заменены (по отношению к последовательности S. melliferum и E. coli). Во второй транскетолазе Q7NC51_MYCGA, аннотированной для M. gallisepticum, аминокислотных замен не определено. Мы обнаружили замены во всех остальных выбранных ферментах и, сопоставив их с данными накопления метаболитов, сделали предположения о влиянии замены на активность фермента .

Особенный интерес вызывают те мутации в ферментах, которые вызывают увеличение активности ферментов. Мы обнаружили мутации, предположительно увеличивающие активность фермента, в активных центрах гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (I158F) и аденин фосфорибозилтрансферазы (L27I и T131) аннотированным для S. melliferum и фруктозобисфосфат альдолазы (V50A)

- S. melliferum и M. gallisepticum (см. Приложение 2) .

На примере фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (Hpt) в таблице 6 продемонстрировано как делались выводы о влиянии мутации на активность фермента .

По отношению к последовательности гомологов (в HPRT_ECOLI, E.coli) в последовательности гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (Hpt, G9XZJ2_SPIME) аминокислота серин в положении 104 заменена на треонин, так же как и в ферменте A9NE16_ACHLI. В последовательности второго фермента Hpt в S. melliferum G9XX66_SPIME нет замены. При этом данные накопления метаболитов указывают на различия в активности протекания реакции в клетках S. melliferum и A. laidlawii. Следовательно, мы предполагаем, что мутация в S104 не является ни усиливающей, ни снижающей активность фермента. У S .

melliferum в активном центре белка Hpt обнаружены замены I158F (относительно E. coli) в первом из двух аннотированных ферментов Hpt G9XZJ2_SPIME, а также усиливающая замены N105K и N105K в обоих ферментах: G9XX66_SPIME и G9XZJ2_SPIME, соответственно. У бактерии A. laidlawii в последовательности фермента Hpt была найдена замена N103A в A9NE16_ACHLI. Анализ накоплений метаболитов показал, что у S. melliferum высоко представлены как субстрат фермента Hpt (гуанин), так и продукт реакции, катализируемой этим белком (ГМФ), тогда как у A. laidlawii и М. gallisepticum гуанин накапливается в большей степени, чем ГМФ. Мы предполагаем, что Hpt имеет более высокую активность в клетках S. melliferum, чем у бактерий A. laidlawii и М. gallisepticum, таким образом, найденная нами мутация I158F, по-видимому, влияет на активный центр фермента, усиливая эффективность связывания фермента с субстратами .

Таблица 6. Мутации в активном центре фермента Hpt в каждом из исследуемых трех видов молликут относительно E .

coli в соответствии с данными о накоплении метаболитов в пути, который протекает с участием Hpt .

–  –  –

Фермент аденин фосфорибозилтрансфераза (Apt) катализирует перенос фосфорибозила с фосфорибозилпирофосфата на аденин с образованием АМФ и неорганического пирофосфата. По отношению к последовательности аденин фосфорибозилтрансферазы Apt в E. coli HPRT_ECOLI аргинин в положении 29 (первый сайт связывания аденин фосфорибозилтрансферазы с АМФ) в белке M .

gallisepticum Q7NBS4_MYCGA заменен на тирозин R29Y, а во втором сайте связывания обнаруженная замена G132A (глицин на аланин) (см. Приложение 2) .

Поскольку кристаллическая структура фермента Apt для E. coli и других бактерий в настоящее время не определена, мы использовали в качестве образца для выравнивания структуру фермента Leishmania donovani, однако сравнивали последовательность с гомологом из E. coli. Интересно, что замена R29Y наблюдается в N-концевой части активного центра, необходимой для связывания AMP. При этом в метаболомном модуле M. gallisepticum определен максимум в виде аденина, который является субстратом для Q7NBS4_MYCGA. Можно предположить, что одна из таких мутаций снижает активность связывания фермента. У S. melliferum определен максимум в виде пары аденин-АМФ, в отличие от M. gallisepticum и A. laidlawii, что косвенно указывает на увеличенную активность фермента L5VS29_SPIME. Мы обнаружили две замены в активных центрах этого фермента: L27I и T131S (см. Приложение 2). Мы предполагаем, что одна из этих замен или обе замены могут быть связаны с усилением активности фермента и выработкой большего количества продукта .

Фермент Fba катализирует процесс расщепления фруктозо-бисфосфата с образованием глицерон-фосфата и глицеральдегид-3-фосфата. За утилизацию глицеральдегид-3-фосфата отвечает фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GapN или Gap). Поэтому накопление глицеральдегид-3-фосфата в M. gallisepticum и S. melliferum может быть следствием повышения активности фермента Fba или снижения активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы .

В последовательности фермента фруктозо-бисфосфат альдолаза (Fba) по отношению к Bacillus anthracis мы определили замену аминокислот V50A в Q7NAJ0_MYCGA и G9XY54_SPIME в M. gallisepticum и S. melliferum (см .

Приложение 2). Мы не обнаружили замен в последовательностях Gap и GapN бактерий и соответственно накопление M. gallisepticum S. melliferum, глицеральдегид-3-фосфата не может быть вызвано слабой активностью утилизирующих белков и указывает на усиливающий активность характер мутаций в белке Fba .

Анализ накоплений метаболитов показал, что пиримидиновый модуль в клетках S. melliferum содержит следующие максимумы УМФ и ЦМФ, в клетках A. laidlawii -уридин и цитидин, а в клетках M. gallisepticum отсутствуют максимумы. Фермент уридинкиназа катализирует реакции фосфорилирования цитидина и уридина с образованием мононуклеотидов и ответственен за образование УМФ и ЦМФ. За накопление УМФ и ЦМФ может отвечать также фермент уридилаткиназа (PyrH), синтезирующий УДФ и ЦДФ из монофосфатов .

Данные указывают на повышающий активность фермента характер влияния аминокислотных замен в уридинкиназе или снижающий активность характер влияния аминокислотных замен в уридилаткиназе S. melliferum. Мы обнаружили (отностительно T. thermophilus) мутации A16G в сайтах связывания субстрата в ферменте Q7NB32_MYCGA бактерии M. gallisepticum и Y159F в ферменте G9Y068_SPIME бактерии S. melliferum (см. Приложение 2). Мы обнаружили (отноститеьлно мутации в сайтах связывания субстрата B. subtilis) уридилаткиназы: для A. laidlawii - N137S в ферменте A9NHC4_ACHLI и для S .

melliferum - N137Q замену в ферменте G9XZS5_SPIME. Так как мутации обнаружены и в ферменте, ответственном за расход УМФ, и в синтезирующем УМФ ферменте, сложно точно определить характер влияния этих мутаций в S .

melliferum .

Мы определили накопление рибозо-5-фосфата в клетках А. laidlawii и множество замен в сайте связывания АТФ рибозо-фосфат-пирофосфокиназы во всех трех видах относительно структуры PrsA E. сoli: R107A в Q7NAR0_MYCGA, S108G в Q7NAR0_MYCGA и G9XZ29_SPIME; а также две замены в петле связывания фосфорибозил-пирофосфата и фермента M222I L218M A9NE81_ACHLI (см. Приложение 2). Мутации PrsA, по-видимому, снижают связываемость с субстратами и активность протекания реакции в клетках M .

gallisepticum и S. melliferum, а мутации в сайте связывания PrsA с фосфо-рибозилпирофосфатом в А. laidlawii не влияют на активность. В сайте связывания субстрата транскетолазы в клетках мы G9Y039_SPIME S. melliferum идентифицировали мутацию S384A (по отношению к последовательности E. coli), однако трудно судить о ее характере, так как данных о накоплении метаболитов в этих клетках не имеется. Мы обнаружили мутации (отноститеьлно B. subtilis) в сайтах связывания с субстратом тимидин киназы (Tdk): в ферменте A9NEC0_ACHLI A. laidlawii - V89A, C148T, C183S, и H186A и в ферменте (см. Приложение 2). Тимидин G9XYA3_SPIME S. melliferum- H186C накапливается только в клетках A. laidlawii, поэтому можно предположить снижение активности тимидин киназы A9NEC0_ACHLI из-за многочисленных замен .

4.10 Исследование адаптации молликут к кислотному воздействию

Процесс инфицирования организма-хозяина бактериями S. melliferum, А .

laidlawii и М. gallisepticum включает в себя этап адаптации бактерий к пониженным значениям pH среды. Например, инфицирование микоплазмами кур и индеек начинается с колонизации дыхательных путей, характеризующихся пониженным значением pH, и дальнейшего развития трахеита и воспалительного процесса. Поэтому клеткам бактерии М. gallisepticum необходимо уметь адаптироваться к кислой среде слизистых организма-хозяина [193, 202]. В свою очередь, пчелы являются основным резервуаром для размножения спироплазм, которые проникают в просвет кишечника через глоточные железы. Клеткам спироплазм приходится непосредственно контактировать с образовавшимся в железах пчел медом, имеющим низкий показатель pH. Пониженная кислотность меда вызвана тем, что глюкозо-оксидаза из секрета глоточных желез пчелы преобразует глюкозу до глюконовой кислоты, которая понижает значение рН образовавшегося меда до рН 4-5 [203]. Способность ахолеплазм выживать при различных воздействиях, включая закисление среды и изменение ионной силы раствора, является результатом их широкого распространения - они найдены почти во всех видах живых организмов и даже в сточных водах [204-207] .

Поскольку в настоящее время механизмы адаптации молликут к кислотному воздействию недостаточно изучены, исследование метаболома, отражающего состояние клеточной активности в определенных условиях, поможет определить эти механизмы .

Для определения предельного уровня кислотного воздействия на клетки, при котором они способны выжить, мы использовали «цветовой тест», позволяющий оценить долю выживших клеток (см. пункт «Определение устойчивости культуры к кислотному и осмотическому воздействию»). Было показано, что минимальные значения рН среды, при которых М. gallisepticum, А .

laidlawii и S. melliferum способны адаптироваться и нормально функционировать в течение одного часа, составляют – 4.8, 5.2, 5.1 - соответственно. Для оценки изменений метаболома при воздействии снижения кислотности были проведены масс-спектрометрические исследования изменения метаболома трех видов молликут. Изменения метаболома оценивались с помощью сервиса «XCMS» (см .

«Сравнительный анализ метаболомов S. melliferum, M. gallisepticum и A .

laidlawii») .

Алгоритм анализа данных состоит из нескольких этапов, описанных в работе выше (пункт 3.7). Обработка данных масс-спектрометрического анализа метаболитов с помощью сервиса XCMS включает этапы обнаружения массспектрометрических пиков веществ, фильтрации шумового сигнала в спектрах, коррекции времени выхода веществ, сопоставления относительных интегральных интенсивностей сигналов между группами сравнения и обнаружения статистически достоверных отличий в двух группах данных. На рисунке 14 представлен пример получаемых результатов при сравнении двух групп образцов с помощью сервиса Приведенный пример включает поиск XCMS .

количественных отличий в двух группах образцов, содержащих 5 и 6 биологических повторов. Вид наложения исходных ионных хроматограмм представлен на рисунке 14а. На рисунке 14б можно увидеть полученные с помощью сервиса XCMS профили нелинейных отклонений времени удерживания аналитов в разных образцах. Результат проведения коррекции времени выхода аналитов в ионных хроматограммах относительно нескольких повторов в двух группах представлен на рисунке 14в. Далее на рисунке 14г представлен пример сопоставления экстрагированных ионных хроматограмм между образцами для одного аналита, содержание которого изменяется при воздействии .

Рисунок 14. Результаты исследования изменения метаболома A. laidlawii в норме и условиях осмотического воздействия в отрицательном режиме получения спектров, полученные с использованием сервиса XCMS [5] .

а- наложение исходных хроматограмм по полному ионному току для обеих групп, разные образцы отмечены разным цветом, прямой линией отмечены контрольные образцы, пунктирной - образцы, находившиеся под воздействием; б- полученные с помощью сервиса XCMS профили нелинейных отклонений времени удерживания аналитов в разных образцах; врезультат коррекции времени выхода веществ с использованием полученного профиля; гсопоставление экстрагированных ионных хроматограмм, соответствующих гуанину (m/z 152.056), в норме (черные цвет) и при осмотическом воздействии (красный цвет) .

В результате исследований мы обнаружили специфическое и общее для трех видов изменение состояния клеток на метаболическом уровне (см. таблицы 7, 8). Для выявления основных метаболических путей, участвующих в адаптации бактерий, метаболиты, внутриклеточная концентрация которых изменяется при различных видах воздействия, были нанесены на реконструированные карты .

В результате было показано, что при кислотном воздействии общими для трех видов микоплазм являются следующие направления изменения метаболома:

происходит уменьшение содержания нейтральных аминокислот и аминокислот с кислотными свойствами, а также накопление в клетках нефосфорилированных сахаров и азотистых оснований .

По результатам общего для трех видов изменения метаболома при кислотном воздействии можно предположить, что состояние клетки характеризуется высокими энергетическими затратами. Специфические изменения метаболома при кислотном воздействии на клетки молликут касаются в основном метаболизма аминокислот и нуклеотидов. В клетках S. melliferum увеличивается содержание,-трегалозы/сахарозы и падает концентрация пролина, глутамина и глутамата. В клетках М. gallisepticum наблюдается повышение содержания наработанного цитруллина, а также основных осмопротекторов - пролина, валина и,-трегалозы/сахарозы. Для А. laidlawii характерно значительно снижение содержания лизина, пролина, валина, глутамина и глутамата .

Обычно бактерии реагируют на подкисление среды увеличением экспрессии ферментов, которые способны преобразовывать метаболиты с кислотными свойствами в нейтральные или метаболиты с нейтральными свойствами в щелочные производные (например, с помощью ферментов аргининдезаминаза и аргининдекарбоксилаза, глутаматдекарбоксилаза) [208]. В аннотации генома А. laidlawii отсутствуют описанные ферменты, однако аннотирован фермент лизиндекарбоксилаза. Наличие лизиндекарбоксилазы является уникальным отличительным свойством этого вида по сравнению с остальными представителями молликут. Лизиндекарбоксилаза - единственный белок в клетках А. laidlawii, способный использовать в качестве субстрата лизин, превращая его в кадаверин. Снижение концентрации лизина в клетках А. laidlawii указывает на активацию лизиндекарбоксилазы при кислотном воздействии на клетки .

Таблица 7. Изменение содержания метаболитов в клетках трех видов молликут при кислотном воздействии .

–  –  –

m/z - среднее значение m/z данного иона в группе образцов;

I1 (контроль) - значение средней нормализованной интегральной интенсивности пика в группе контрольных образцов;

I2 (опыт) - значение средней нормализованной интегральной интенсивности пика в группе образцов, находившихся под воздействием;

I2/I1 - отношение средних нормализованных интегральных интенсивностей;

csh - количество метаболита в контрольном образце (рН = 6.5) превышает количество этого соединения в клетках, подвергнутых воздействию кислоты;

csh - количество метаболита в контрольном образце меньше, чем количество этого соединения в клетках, подвергнутых воздействию кислоты .

Мы предполагаем, что декарбоксилирование лизина является одним из механизмов адаптации А. laidlawii при кислотном воздействии. Такой механизм не характерен для двух других видов микоплазм - М. gallisepticum и S. melliferum, что может быть связано с отсутствием у А. laidlawii специфичности к организмухозяину и широким распространением ахолеплазм в природе .

Другим известным способом адаптации бактерий к кислотному воздействию является дезаминирование щелочных аминокислот с выделением аммиака. Например, подщелачивающий среду аммиак может быть получен при деградации L-гистидина, например, путем активации фермента L-гистидинаммониелазы, обнаруженного в клетках уреаплазмы [209]. Одним из самых важных путей адаптации микроорганизмов к кислотному воздействию по механизму дезаминирования является путь дезаминирования аргинина, сопровождающийся образованием АТФ. Аммиак, производимый в процессе дезаминирования аргинина, способен подщелачивать внутриклеточную среду и, таким образом, помогать выживанию культуры при закислении внешней среды [92]. В процессе реакций этого пути аргинин преобразуется в цитруллин и аммиак, орнитин транскарбамилаза преобразует цитруллин в орнитин и карбамилфосфат, и карбаматкиназа расщепляет карбамилфосфат до аммиака и СО2, генерируя АТФ (см. рис. 14). Система дезаминирования аргинина требует также наличия аргинин/орнитинового антипортера, белка избавляющего клетку от конечного продукта – орнитина [181] .

Рисунок 14. Метаболический путь дезаминирования аргинина .

Метаболиты отмечены кружками, ферменты, катализирующие реакции отмечены ромбами, детектированные метаболиты отмечены зеленым цветом .

Некоторые микоплазмы (M. hominis, М. arthritidis, М. gallinarum и др.) используют путь дезаминирования аргинина в качестве альтернативного источника энергии [210]. В двух из трех исследуемых нами бактерий этот путь ферментативно незавершен [23, 175, 178]. Согласно данным протеогеномной аннотации различных видов молликут только S. melliferum содержит белки, ответственные за проведение всех реакций пути дезаминирования аргинина. У М .

gallisepticum не хватает орнитин карбамоилтрансферазы и карбамат-киназы, тогда как у А. отсутствует центральный фермент этого пути – laidlawii аргининдезаминаза [182]. Поэтому А. laidlawii. не может использовать путь дезаминирования аргинина в качестве механизма адаптации к кислотному воздействию. В клетках S. melliferum мы не наблюдаем значительных изменений содержания компонентов этого пути в процессе кислотного воздействия, что можно объяснить наличием всех ферментов наличие (включая аргинин/орнитинового антипортера) необходимых для проведения реакций дезаминирования. В случае бактерии М. gallisepticum, у которой орнитин транскарбамилаза не аннотирована, цикл дезаминирования аргинина прерван после реакции образования цитруллина. Мы предполагаем, что причиной накопления цитруллина в клетках М. gallisepticum является отсутствие ферментов, утилизирующих цитруллин, а также белков специфического эффлюкса наработанного цитруллина .

Наряду с увеличением содержания цитруллина, мы обнаружили увеличение содержания всех основных осмопротекторов (пролина, валина и трегалозы/сахарозы) в клетках М. gallisepticum. Накопление трегалозы при кислотном воздействии характерно также для клеток S. melliferum. Мы предполагаем, что механизм адаптации клеток М. gallisepticum к кислотному воздействию сопряжен с адаптацией к осмотическому воздействию. Накопление трегалозы клетками молликут в условиях внешнего воздействия не является уникальным явлением. Многие микробы накапливают дисахариды в качестве ответа на осмотический и тепловой стрессы, а также голод и воздействие высушивания .

Например, в отсутствие экзогенных осмопротекторов (таких как бетаин, бетаиновый альдегид, холин, холин сульфат и др.) клетки E. coli могут накапливать трегалозу до уровней, при которых осмолярность цитоплазмы повышается на 20% [211]. Мы предполагаем, что механизм адаптации клеток М .

gallisepticum к кислотному воздействию сопряжен с адаптацией к осмотическому воздействию .

4.11 Исследование адаптации молликут к осмотическому воздействию Другим физиологическим видом воздействия, с которым сталкиваются организмы-паразиты, является осмотическое воздействие. В условиях увеличения осмотического давления рост культуры замедляется, тормозятся процессы биосинтеза, и снижается интенсивность дыхания .

Уникальной особенностью исследуемых видов молликут является способность выживать при воздействии высоких концентраций соли в питательной среде- до 1000 мМ (определено с помощью метода «цветовой тест»). Мы провели масс-спектрометрическое исследование изменения метаболома трех видов молликут при осмотическом воздействии (600 мМ NaCl) .

По результатам исследований мы обнаружили общие и специфические изменения состояния клеток при осмотическом воздействии на метаболическом уровне (см .

таблица 8). Метаболиты, внутриклеточная концентрация которых изменяется, были нанесены на реконструированные схемы метаболизма исследуемых бактерий и выявлены основные направления изменений метаболома .

В результате анализа метаболома бактерий S. melliferum, A. laidlawii и М .

gallisepticum в условиях высокого осмотического давления внешней среды были выявлены следующие общие для трех видов направления изменения метаболома:

- увеличение содержания нейтральных и отрицательно заряженных аминокислот;

- уменьшение содержания свободных азотистых оснований;

- увеличение содержания нефосфорилированных форм сахаров .

Таблица 8. Изменение содержания метаболитов в клетках трех видов молликут при осмотическом воздействии .

–  –  –

m/z - среднее значение m/z данного иона в группе образцов;

I1 (контроль) - значение средней нормализованной интегральной интенсивности пика в группе контрольных образцов;

I1 (опыт) - значение средней нормализованной интегральной интенсивности пика в группе образцов, находившихся под воздействием;

I2/I1 - отношение средних интегральных интенсивностей;

csh - количество метаболита в контрольном образце (NaCl, 150 мМ) превышает количество этого соединения в клетках, подвергнутых осмотическому воздействию;

csh - количество метаболита в контрольном образце меньше, чем количество этого соединения в клетках, подвергнутых осмотическому воздействию (NaCl, 600 мМ);

Накопление нейтральных и отрицательно заряженных аминокислот в клетке при осмотическом воздействии является способом выравнивания давления внутри клетки бактерии. Известно, что именно импорт калия в клетку является универсальным ответом клеток на осмотическое воздействие. Аминокислоты, проявляющие кислотные свойства, способны диссоциировать с образованием анионов, подобных глутамат-иону, необходимых для компенсации ионов калия, импортируемых внутрь клетки во время осмотического стресса. Снижение содержания свободных азотистых оснований и увеличение содержания сахаров и их производных свидетельствуют о синтезе нуклеотидов и об отсутствии недостатка клеток в энергии .

Мы считаем, что для выживания в условиях осмотического воздействия клетки молликут используют механизмы адаптации, включающие импорт в клетку ионов K+ и иона глутамата, что позволяет увеличить цитоплазматическое осмотическое давление с минимальным влиянием на ионный состав клетки .

Из литературных источников известно, что для бактерий наиболее быстрым ответом на осмотическое воздействие является увеличение внутриклеточной концентрации ионов K+ за счет его импорта с помощью трех основных ферментов Trk, Kdp и Kup [212]. В геноме клеток М. gallisepticum, S .

melliferum и А. laidlawii аннотированы гены только одной системы импорта ионов K+ - Trk (MGA_0085, ACL_1025, SPM_01850). Одна из субъединиц этой системы, периферический мембранный белок TrkA, связывает НАД (НАДН) и регулирует поглощение ионов калия .

Одновременно с увеличением притока ионов К+ внутрь клетки, уменьшается внутриклеточный уровень содержания путресцина в связи с увеличением его экскреции. Путресцин является двухвалентным катионным полиамином. Таким образом, двухвалентный путресцин заменяется одновалентным ионом К+, что позволяет увеличить цитоплазматическое осмотическое давление с минимальным влиянием на внутриклеточную ионную силу. Следует отметить, что фермент PotA, ответственный за выведение путресцина из клеток аннотирован для всех трех молликут (MGA_0135, SPM_04452, ACL_0471) [23, 175, 178] .

Накопление положительных ионов K+ влечет за собой изменение концентраций анионных соединений в клетке. Основным анионным соединением, участвующим в осморегуляции бактерий, является анион глутаминовой кислоты – глутамат [212]. Многие бактерии накапливают глутамат в ответ на осмотический стресс. Накапливающийся глутамат действует в качестве осмолита, необходимого, чтобы увеличить внутриклеточную концентрацию растворенных веществ и уменьшить потери воды путем осмоса [213]. Кроме того, глутамат выступает в качестве противоиона для накапливающегося K+ [214]. В клетках E .

coli и других кишечных бактериях, глутаминовая кислота синтезируется двумя ферментами: глутаматдегидрогеназой (Gch) и глутаматсинтазой (Gs). Глутамат также может быть получен путем трансаминирования 2-кетоглутарата и дезаминирования глутамина [188] .

В геноме молликут не аннотировано таких ферментов синтеза глутамата, как глутаматдегидрогеназа или глутаматсинтаза, однако этот метаболит может быть получен клеткой с помощью гидролиза глутамина или с помощью транспорта глутамата из питательной среды. В клетках А. laidlawii аннотирована аминотрансфераза, использующая 2-оксоглутарат и лейцин или валин в качестве субстратов для производства глутамата (ACL_1151). Клетки S. melliferum имеют фермент ГМФ-синтазу, которая катализирует процесс преобразования ксантозин монофосфата в ГМФ с сопряженным переходом глутамина в глутамат .

Некоторые соединения, присутствующие в среде, могут стимулировать рост бактерий при гиперосмотических воздействиях. Эти соединения являются осмопротекторами. Осмопротекторы являются цвиттерионами и по структуре напоминают глицинбетаин и пролин. К потенциальным осмопротекторам относятся следующие соединения: трегалоза, пролин, бетаин, бетаиновый альдегид, пролинбетаин, холин, холин-о-сульфат, -диметилсульфопропионат и карнитин. Все механизмы осмопротекции демонстрируют иерархию функций .

Первоначально внутриклеточный уровень ионов К+ резко возрастает в течение 20 минут. Накопление глутамата следует несколько медленнее. Клетки восстанавливаются, как только тургор будет восстановлен. Спустя час осмотического воздействия уровень содержания трегалозы растет, а уровень содержания К+/глутамата снижается. Если в клетку импортировать извне экзогенные осмопротекторы, такие как бетаиновый альдегид, концентрация трегалозы начнет снижаться при продолжающемся снижении содержания ионов К+/глутамата. Повышению уровня содержания трегалозы соответствует начало процессов биосинтеза высокомолекулярных соединений соответствует, при условии, что клетки способны расщеплять и утилизировать трегалозу [215]. В отсутствие экзогенных осмопротекторов клетки E. coli могут синтезировать и накапливать трегалозу до уровней, при которых осмомолярность цитоплазмы повышается на 20% [211]. Белки, ответственные за синтез трегалозы, отсутствуют в аннотации исследуемых молликут, поэтому трегалоза в нефосфорилированной форме может быть только импортирована из внешней среды в клетки S. melliferum, A. laidlawii и М. gallisepticum [23, 175, 178]. Наличие описанных ферментов, ответственных за адаптацию к осмотическому воздействию у молликут, позволяет предположить увеличение содержания глутамата и трегалозы и накопление экзогенных осмопротекторов, таких как пролин, бетаин или холин .

Результаты масс-спектрометрического анализа показали, что изменения метаболома при осмотическом воздействии на клетки всех трех видов исследуемых микоплазм, затрагивают в основном метаболизм аминокислот. В метаболоме всех трех видов наблюдается увеличение содержания глутаминовой кислоты. Это явление вполне понятно, поскольку глутамат является основным анионным соединением, участвующим в осморегуляции. Многие бактерии накапливают его в ответ на осмотическое воздействие. Накапливающийся глутамат действует в качестве осмолита, необходимого для увеличения внутриклеточной концентрации растворенных веществ и в качестве противоиона для накапливающегося в клетках М. gallisepticum, S. melliferum и А. laidlawii K+ .

Кроме глутамат-иона в клетках S. melliferum было обнаружено увеличение содержания глутамина и цитруллина. Глутамин - соединение, содержание которого в клетке, находится в балансе с содержанием глутамата, так как их взаимный переход часто используется ферментами для переноса аминогруппы .

Увеличение содержания цитруллина свидетельствует об активности аргининдезаминазного пути. Аргининдезаминазный путь кроме адаптации к кислотному воздействию, используется клетками также в качестве дополнительного источника энергетического эквивалента АТФ, поэтому активация этого пути в клетках при осмотическом шоке является ожидаемой (кроме того, в клетках мы также наблюдаем увеличение S. melliferum содержания аргинина). Нами также показано, что в клетках М. gallisepticum и S .

melliferum наблюдаются изменения содержания пролина и трегалозы .

Общей характеристикой изменений метаболома трех видов в условиях осмотического и кислотного воздействий является накопление сахаров в клетке, что свидетельствует об энергетических затратах в процессе адаптации. В условиях осмотического стресса активируются процессы биосинтеза высокомолекулярных соединений. Азотистые основания служат предшественниками синтеза множества соединений в клетке, поэтому при осмотическом воздействии не наблюдается увеличения их содержания, как при кислотном воздействии. Мы предполагаем, что изменение аминокислотного состава клеток является одним из основных способов приспособления клеток молликут к внешнему воздействию. На активное участие аминокислот в адаптации указывают также данные исследований транскриптомных изменений в клетках Mycoplasma genitalium, проведенных группой профессора Бэйсмана .

Авторы продемонстрировали увеличение экспрессии пермеаз, которые участвуют в импорте аминокислот и других субстратов из богатой среды в клетку при осмотическом воздействии Описанные специфические изменения [28] .

метаболома в клетках S. melliferum, A. laidlawii и М. gallisepticum под влиянием кислотного и осмотического воздействия свидетельствуют о том, что механизмы адаптации у этих трех видов различны .

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе данной работы с использованием метода высокоэффективной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) на метаболическом уровне исследованы принципы организации метаболизма трех видов бактерий класса молликут A. laidlawii, S. melliferum, M. gallisepticum. На основе данных протеогеномной аннотации построены карты метаболизма A. laidlawii, S .

melliferum, M. gallisepticum. Для каждого вида проведено уточнение первичной реконструкции и построены карты метаболизма без пробелов, изолированных реакций или неполных метаболических путей в схеме. С помощью метода ВЭЖХМС/МС с использованием метода гидрофильной хроматографии был проведен анализ метаболома бактерий A. laidlawii, M. gallisepticum, S. melliferum, культивируемых в оптимальных условиях. Метаболические пути трех исследуемых видов бактерий класса молликут были сопоставлены между собой .

Выявлены особенности метаболизма, характерные для каждого вида. Проведен сравнительный анализ относительных концентраций метаболитов в клетках M .

gallisepticum, A. laidlawii и S. melliferum. Данные об относительном содержании метаболитов в трех видах молликут сопоставлены с наличием аминокислотных замен в активных центрах ферментов, катализирующих реакции с участием этих метаболитов. Сделаны выводы о характере возможного влияния таких замен на активность ферментов. Проведен анализ изменения метаболома бактерий S .

melliferum, A. laidlawii и M. gallisepticum в условиях кислотного и осмотического воздействий и предложены механизмы адаптации A. laidlawii, S. melliferum, M .

gallisepticum к таким видам воздействия .

6. ВЫВОДЫ

На основе данных протеогеномной аннотации были 1 .

реконструированы карты метаболизма для A. laidlawii, S. melliferum, M .

gallisepticum .

С помощью метода ВЭЖХ-МС/МС были идентифицированы 75, 2 .

74 и 74 метаболита в клетках А. laidlawii, М. gallisepticum, S. melliferum соответственно .

В клетках исследуемых видов молликут были детектированы 3 .

метаболиты пентозофосфатного пути, что указывает на его активность; были предложены варианты протекания реакций этого пути при отсутствии фермента трансальдолазы у S. melliferum, A. laidlawii и M. gallisepticum. Была выявлена активность пути биосинтеза терпеноидов в клетках всех трех видов молликут. В клетках A. laidlawii была продемонстрирована активность пути биосинтеза рибофлавинов .

Сравнение относительного содержания метаболитов в клетках 4 .

показало, что метаболизм пуринов в S. melliferum отличается от метаболизма M .

gallisepticum и A. laidlawii тем, что направлен в сторону образования нуклеотидмонофосфатов из азотистых оснований, а не на их расщепление .

Найденные отличия в метаболизме углеводов свидетельствуют о лимитировании процессов расщепления углеводов в клетках А. laidlawii и замедленной утилизацией фосфо-рибозо-пирофосфата - источика фосфо-рибозильной группы в синтезе нуклеотидов, в то время как в S. melliferum и М. gallisepticum активно расщепляют углеводы .

Полученные данные о накоплении метаболитов были 5 .

сопоставлены с аминокислотными заменами в активных центрах ферментов .

Были обнаружены аминокислотные замены, способные усиливать активность гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы, аденин фосфорибозилтрансферазы и фруктозо-бисфосфат-альдолазы .

Были проведены исследования изменения метаболома трех видов 6 .

молликут при кислотном воздействии. Данные позволили предположить, что А .

laidlawii имеет механизм адаптации отличный от М. gallisepticum и S. melliferum и для выживания при кислотном воздействии использует декарбоксилирование лизина. В клетках М. gallisepticum механизм адаптации к кислотному воздействию связан с активацией цикла дезаминирования аргинина .

Были проведены исследования изменения метаболома трех видов 7 .

молликут при осмотическом воздействии. Выявлено, что при осмотическом воздействии в клетках A. laidlawii, S. melliferum, M. gallisepticum происходит увеличение содержания глутамата, что указывает на активацию классических механизмов адаптации и является следствием импорта в клетку ионов K+ .

Накопление нейтральных и кислых аминокислот в клетке при осмотическом воздействии, вероятно, является способом выравнивания давления внутри клетки .

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность научному руководителю к.б.н., доценту Камашеву Дмитрию Эдуардовичу и заместителю директора по научной работе ФГБУН «НИИ ФХМ» ФМБА, д.б.н., профессору, член-корр. РАН Говоруну Вадиму Марковичу за предоставление темы диссертационной работы, помощь, поддержку и чуткое руководство при ее выполнении .

Выражаю глубокую признательность сотруднице лаборатории молекулярной генетики человека ФГБУН «НИИ ФХМ» ФМБА Захаржевской Наталье Борисовне и коллективу лаборатории протеомного анализа ФГБУН «НИИ ФХМ»

ФМБА за полезные рекомендации и за помощь в подготовке диссертационной работы .

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Rogers F.B. Medical subject headings // Bull Med Libr Assoc. 1963. Vol. 51, № 1 .

P. 114-6 .

Razin S. The mycoplasmas // Microbiol Rev. 1978. Vol. 42, № 2. P. 414-70 .

2 .

3. Yus E., Maier T., Michalodimitrakis K., et al. Impact of genome reduction on bacterial metabolism and its regulation // Science. 2009. Vol. 326, № 5957. P .

1263-8 .

4. Saghatelian A., Cravatt B.F. Discovery metabolite profiling--forging functional connections between the proteome and metabolome // Life Sci. 2005. Vol. 77, №

14. P. 1759-66 .

5. Smith C.A., Want E.J., O'Maille G., et al. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 3. P. 779-87 .

6. Allen J., Davey H.M., Broadhurst D., et al. High-throughput classification of yeast mutants for functional genomics using metabolic footprinting // Nat Biotechnol. 2003. Vol. 21, № 6. P. 692-6 .

7. Saito N., Robert M., Kitamura S., et al. Metabolomics approach for enzyme discovery // J Proteome Res. 2006. Vol. 5, № 8. P. 1979-87 .

8. Heinemann M., Sauer U. Systems biology of microbial metabolism // Curr Opin Microbiol. Vol. 13, № 3. P. 337-43 .

9. Loh K.D., Gyaneshwar P., Markenscoff Papadimitriou E., et al. A previously undescribed pathway for pyrimidine catabolism // Proc Natl Acad Sci U S A .

2006. Vol. 103, № 13. P. 5114-9 .

10. Peyraud R., Kiefer P., Christen P., et al. Demonstration of the ethylmalonyl-CoA pathway by using 13C metabolomics // Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. Vol .

106, № 12. P. 4846-51 .

11. Olszewski K.L., Mather M.W., Morrisey J.M., et al. Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum // Nature. Vol. 466, № 7307. P. 774-8 .

12. Amador-Noguez D., Feng X.J., Fan J., et al. Systems-level metabolic flux profiling elucidates a complete, bifurcated tricarboxylic acid cycle in Clostridium acetobutylicum // J Bacteriol. Vol. 192, № 17. P. 4452-61 .

13. Kresnowati M.T., van Winden W.A., Almering M.J., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation // Mol Syst Biol. 2006. Vol. 2, № P. 49 .

14. Wu L., van Dam J., Schipper D., et al. Short-term metabolome dynamics and carbon, electron, and ATP balances in chemostat-grown Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 113-7D following a glucose pulse // Appl Environ Microbiol .

2006. Vol. 72, № 5. P. 3566-77 .

15. Reitzer L. Nitrogen assimilation and global regulation in Escherichia coli // Annu Rev Microbiol. 2003. Vol. 57, № P. 155-76 .

16. Wodke J.A., Puchalka J., Lluch-Senar M., et al. Dissecting the energy metabolism in Mycoplasma pneumoniae through genome-scale metabolic modeling // Mol Syst Biol. Vol. 9, № P. 1-19 .

17. Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: sophisticated, reemerging, and burdened by their notoriety // Emerg Infect Dis. 1997. Vol. 3, № 1. P. 21-32 .

18. Bove J.M. Spiroplasmas: infectious agents of plants, arthropods and vertebrates // Wien Klin Wochenschr. 1997. Vol. 109, № 14-15. P. 604-12 .

19. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas // Microbiol Mol Biol Rev. 1998. Vol. 62, № 4. P. 1094-156 .

20. Robison K., Gilbert W., Church G.M. More haemophilus and Mycoplasma genes // Science. 1996. Vol. 271, № 5253. P. 1302b-3b .

Razin S. Physiology of mycoplasmas // Adv Microb Physiol. 1973. Vol. 10, № 21 .

P. 1-80 .

22. Razin S., Michmann J., Shimshoni Z. The Occurrence of Mycoplasma (Pleuropneumonia-Like Organisms, Pplo) in the Oral Cavity of Dentulous and Edentulous Subjects // J Dent Res. 1964. Vol. 43, № P. 402-5 .

23. Lazarev V.N., Levitskii S.A., Basovskii Y.I., et al. Complete genome and proteome of Acholeplasma laidlawii // J Bacteriol. 2011. Vol. 193, № 18. P .

4943-53 .

24. Laidlaw P.P., Elford,W J. A new group of filterable organisms // B Biol. Sci .

1936. Vol. № 120. P. 292-303 .

25. Leach R.H. Comparative studies of mycoplasma of bovine origin // Ann N Y Acad Sci. 1967. Vol. 143, № 1. P. 305-16 .

26. Stipkovits L. The pathogenicity of avian mycoplasmas // Zentralbl Bakteriol Orig A. 1979. Vol. 245, № 1-2. P. 171-83 .

27. Cocaign-Bousquet M., Even S., Lindley N.D., et al. Anaerobic sugar catabolism in Lactococcus lactis: genetic regulation and enzyme control over pathway flux // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. Vol. 60, № 1-2. P. 24-32 .

28. Zhang W., Baseman J.B. Transcriptional response of Mycoplasma genitalium to osmotic stress // Microbiology. Vol. 157, № Pt 2. P. 548-56 .

29. Pollack J.D., Tryon V.V., Beaman K.D. The metabolic pathways of Acholeplasma and Mycoplasma: an overview // Yale J Biol Med. 1983. Vol. 56, № 5-6. P. 709-16 .

30. Huynen M.A., Dandekar T., Bork P. Variation and evolution of the citric-acid cycle: a genomic perspective // Trends Microbiol. 1999. Vol. 7, № 7. P. 281-91 .

Miles R.J. Catabolism in mollicutes // J Gen Microbiol. 1992. Vol. 138, № 9. P .

31 .

1773-83 .

32. Pollack J.D., Williams M.V., McElhaney R.N. The comparative metabolism of the mollicutes (Mycoplasmas): the utility for taxonomic classification and the relationship of putative gene annotation and phylogeny to enzymatic function in the smallest free-living cells // Crit Rev Microbiol. 1997. Vol. 23, № 4. P. 269Kenri T., Horino A., Matsui M., et al. Complete genome sequence of Mycoplasma pneumoniae type 2a strain 309, isolated in Japan // J Bacteriol .

2012. Vol. 194, № 5. P. 1253-4 .

34. Fraser C.M., Gocayne J.D., White O., et al. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium // Science. 1995. Vol. 270, № 5235. P. 397-403 .

35. Taylor R.R., Varsani H., Miles R.J. Alternatives to arginine as energy sources for the non-fermentative Mycoplasma gallinarum // FEMS Microbiol Lett. 1994 .

Vol. 115, № 2-3. P. 163-7 .

36. Zhu P.P., Peterkofsky A. Sequence and organization of genes encoding enzymes involved in pyruvate metabolism in Mycoplasma capricolum // Protein Sci. 1996 .

Vol. 5, № 8. P. 1719-36 .

37. Ruepp A., Soppa J. Fermentative arginine degradation in Halobacterium salinarium (formerly Halobacterium halobium): genes, gene products, and transcripts of the arcRACB gene cluster // J Bacteriol. 1996. Vol. 178, № 16. P .

4942-7 .

38. Himmelreich R., Plagens H., Hilbert H., et al. Comparative analysis of the genomes of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25, № 4. P. 701-12 .

39. Pereyre S., Sirand-Pugnet P., Beven L., et al. Life on arginine for Mycoplasma hominis: clues from its minimal genome and comparison with other human urogenital mycoplasmas // PLoS Genet. 2009. Vol. 5, № 10., e1000677. P. 1-13

40. Romano N., Tolone G., Ajello F., et al. Adenosine 5'-triphosphate synthesis induced by urea hydrolysis in Ureaplasma urealyticum // J Bacteriol. 1980. Vol .

144, № 2. P. 830-2 .

41. Smith D.G., Russell W.C., Ingledew W.J., et al. Hydrolysis of urea by Ureaplasma urealyticum generates a transmembrane potential with resultant ATP synthesis // J Bacteriol. 1993. Vol. 175, № 11. P. 3253-8 .

42. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., et al. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae // Nucleic Acids Res. 1996 .

Vol. 24, № 22. P. 4420-49 .

43. Cordwell S.J., Basseal D.J., Pollack J.D., et al. Malate/lactate dehydrogenase in mollicutes: evidence for a multienzyme protein // Gene. 1997. Vol. 195, № 2. P .

113-20 .

44. Pachkov M., Dandekar T., Korbel J., et al. Use of pathway analysis and genome context methods for functional genomics of Mycoplasma pneumoniae nucleotide metabolism // Gene. 2007. Vol. 396, № 2. P. 215-25 .

45. Francke C., Siezen R.J., Teusink B. Reconstructing the metabolic network of a bacterium from its genome // Trends Microbiol. 2005. Vol. 13, № 11. P. 550-8 .

46. Barthelmes J., Ebeling C., Chang A., et al. BRENDA, AMENDA and FRENDA:

the enzyme information system in 2007 // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35, № Database issue. P. D511-4 .

47. Boutet E., Lieberherr D., Tognolli M., et al. UniProtKB/Swiss-Prot // Methods Mol Biol. 2007. Vol. 406, № P. 89-112 .

48. Karp P.D., Paley S., Romero P. The Pathway Tools software // Bioinformatics .

2002. Vol. 18 Suppl 1, № P. S225-32 .

49. Ellis L.B., Roe D., Wackett L.P. The University of Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database: the first decade // Nucleic Acids Res .

2006. Vol. 34, № Database issue. P. D517-21 .

50. Teusink B., van Enckevort F.H., Francke C., et al. In silico reconstruction of the metabolic pathways of Lactobacillus plantarum: comparing predictions of nutrient requirements with those from growth experiments // Appl Environ Microbiol. 2005. Vol. 71, № 11. P. 7253-62 .

51. Osterman A., Overbeek R. Missing genes in metabolic pathways: a comparative genomics approach // Curr Opin Chem Biol. 2003. Vol. 7, № 2. P. 238-51 .

52. Ma H., Zeng A.P. Reconstruction of metabolic networks from genome data and analysis of their global structure for various organisms // Bioinformatics. 2003 .

Vol. 19, № 2. P. 270-7 .

53. Kummel A., Panke S., Heinemann M. Systematic assignment of thermodynamic constraints in metabolic network models // BMC Bioinformatics. 2006. Vol. 7, № 512 P. 312-20 .

54. Ren Q., Kang K.H., Paulsen I.T. TransportDB: a relational database of cellular membrane transport systems // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № Database issue. P. D284-8 .

55. Feist A.M., Henry C.S., Reed J.L., et al. A genome-scale metabolic reconstruction for Escherichia coli K-12 MG1655 that accounts for 1260 ORFs and thermodynamic information // Mol Syst Biol. 2007. Vol. 3, № 121 P. 1-12 .

56. Gates S.C., Sweeley C.C. Quantitative metabolic profiling based on gas chromatography // Clin Chem. 1978. Vol. 24, № 10. P. 1663-73 .

57. Horning E.C., Horning, M. G. Human metabolic profiles obtained by GC and GC/MS // J. Chromatogr. Sci. 1971. Vol. 9, № 129. P. 1-18 .

58. Tweeddale H., Notley-McRobb L., Ferenci T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis // J Bacteriol. 1998. Vol. 180, № 19. P. 5109-16 .

59. Maharjan R.P., Ferenci T. Global metabolite analysis: the influence of extraction methodology on metabolome profiles of Escherichia coli // Anal Biochem. 2003 .

Vol. 313, № 1. P. 145-54 .

60. Sauer U., Lasko D.R., Fiaux J., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism // J Bacteriol. 1999. Vol. 181, № 21. P. 6679-88 .

61. Villas-Boas S.G., Hojer-Pedersen J., Akesson M., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods // Yeast. 2005. Vol .

22, № 14. P. 1155-69 .

62. Lange H.C., Eman M., van Zuijlen G., et al. Improved rapid sampling for in vivo kinetics of intracellular metabolites in Saccharomyces cerevisiae // Biotechnol Bioeng. 2001. Vol. 75, № 4. P. 406-15 .

63. Jozefczuk S., Klie S., Catchpole G., et al. Metabolomic and transcriptomic stress response of Escherichia coli // Mol Syst Biol. Vol. 6, № 364 P. 1-18

64. Ikeda T.P., Shauger A.E., Kustu S. Salmonella typhimurium apparently perceives external nitrogen limitation as internal glutamine limitation // J Mol Biol. 1996 .

Vol. 259, № 4. P. 589-607 .

65. Szymanski J., Jozefczuk S., Nikoloski Z., et al. Stability of metabolic correlations under changing environmental conditions in Escherichia coli--a systems approach // PLoS One. 2009. Vol. 4, № 10. P. 1-15

66. Faijes M., Mars A.E., Smid E.J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum // Microb Cell Fact. 2007. Vol. 6, № 27. P 1-8

67. Link H., Anselment B., Weuster-Botz D. Leakage of adenylates during cold methanol/glycerol quenching of Escherichia coli // 2008. Vol. 4 № 3 P. 240-7

68. Winder C.L., Dunn W.B., Schuler S., et al. Global metabolic profiling of Escherichia coli cultures: an evaluation of methods for quenching and extraction of intracellular metabolites // Anal Chem. 2008. Vol. 80, № 8. P. 2939-48 .

69. Mashego M.R., Wu L., Van Dam J.C., et al. MIRACLE: mass isotopomer ratio analysis of U-13C-labeled extracts. A new method for accurate quantification of changes in concentrations of intracellular metabolites // Biotechnol Bioeng. 2004 .

Vol. 85, № 6. P. 620-8 .

70. Ohashi Y., Hirayama A., Ishikawa T., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS // Mol Biosyst. 2008. Vol. 4, №

2. P. 135-47 .

71. Wittmann C., Kromer J.O., Kiefer P., et al. Impact of the cold shock phenomenon on quantification of intracellular metabolites in bacteria // Anal Biochem. 2004 .

Vol. 327, № 1. P. 135-9 .

72. Bolten C.J., Wittmann C. Appropriate sampling for intracellular amino acid analysis in five phylogenetically different yeasts // Biotechnol Lett. 2008. Vol .

30, № 11. P. 1993-2000 .

73. Taymaz-Nikerel H., de Mey M., Ras C., et al. Development and application of a differential method for reliable metabolome analysis in Escherichia coli // Anal Biochem. 2009. Vol. 386, № 1. P. 9-19 .

74. Wu X., Li N., Li H., et al. An optimized method for NMR-based plant seed metabolomic analysis with maximized polar metabolite extraction efficiency, signal-to-noise ratio, and chemical shift consistency // Analyst. Vol. 139, № 7. P .

1769-78 .

75. Rabinowitz J.D., Kimball E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli // Anal Chem. 2007. Vol. 79, № 16. P. 6167-73 .

76. Hollywood K., Brison D.R., Goodacre R. Metabolomics: current technologies and future trends // Proteomics. 2006. Vol. 6, № 17. P. 4716-23 .

77. Canelas A.B., ten Pierick A., Ras C., et al. Quantitative evaluation of intracellular metabolite extraction techniques for yeast metabolomics // Anal Chem. 2009 .

Vol. 81, № 17. P. 7379-89 .

78. Ortmayr K., Stanetty,C., Kosma, P., Hann, S., Koellensperger G. Quantitative determination of NADP+ and NADPH using LC-MS: Workflow evaluation is crucial in metabolomics // Journal. 2013, P. 1-5

79. Monton M.R., Soga T. Metabolome analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1168, № 1-2. P. 237-46 .

80. Timischl B., Dettmer K., Kaspar H., et al. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics// Electrophoresis. 2008. Vol. 29, № 10. P. 2203-14 .

81. Yang S., Hoggard J.C., Lidstrom M.E., et al. Comprehensive discovery of C labeled metabolites in the bacterium Methylobacterium extorquens AM1 using gas chromatography-mass spectrometry // J Chromatogr A. Vol. 1317, № 22 P .

175-85 .

82. Azizan K.A., Baharum S.N., Mohd Noor N. Metabolic profiling of Lactococcus lactis under different culture conditions // Molecules. Vol. 17, № 7. P. 8022-36 .

83. Munger J., Bajad S.U., Coller H.A., et al. Dynamics of the cellular metabolome during human cytomegalovirus infection // PLoS Pathog. 2006. Vol. 2, № 12. P .

132-5 .

84. van der Kloet F.M., Hendriks M., Hankemeier T., et al. A new approach to untargeted integration of high resolution liquid chromatography-mass spectrometry data // Anal Chim Acta. Vol. 801, № P. 34-42 .

85. Bajad S., Shulaev V. LC-MS-based metabolomics // Methods Mol Biol. Vol. 708, № P. 213-28 .

86. Guillarme D., Nguyen D.T., Rudaz S., et al. Recent developments in liquid chromatography--impact on qualitative and quantitative performance // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1149, № 1. P. 20-9 .

87. Wilson I.D., Nicholson J.K., Castro-Perez J., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies // J Proteome Res. 2005. Vol. 4, № 2. P. 591-8 .

88. Nguyen D.T., Guillarme D., Rudaz S., et al. Fast analysis in liquid chromatography using small particle size and high pressure // J Sep Sci. 2006 .

Vol. 29, № 12. P. 1836-48 .

89. Walles M., Gauvin C., Morin P.E., et al. Comparison of sub-2-microm particle columns for fast metabolite ID // J Sep Sci. 2007. Vol. 30, № 8. P. 1191-9 .

90. Colebatch G., Desbrosses G., Ott T., et al. Global changes in transcription orchestrate metabolic differentiation during symbiotic nitrogen fixation in Lotus japonicus // Plant J. 2004. Vol. 39, № 4. P. 487-512 .

91. Jonsson P., Gullberg J., Nordstrom A., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS // Anal Chem. 2004 .

Vol. 76, № 6. P. 1738-45 .

92. Koek M.M., Muilwijk B., van der Werf M.J., et al. Microbial metabolomics with gas chromatography/mass spectrometry // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 4. P .

1272-81 .

93. Soga T., Ohashi Y., Ueno Y., et al. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry // J Proteome Res. 2003. Vol. 2, №

5. P. 488-94 .

94. Soga T., Ueno Y., Naraoka H., et al. Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry // Anal Chem. 2002 .

Vol. 74, № 10. P. 2233-9 .

95. Edwards J.L., Chisolm C.N., Shackman J.G., et al. Negative mode sheathless capillary electrophoresis electrospray ionization-mass spectrometry for metabolite analysis of prokaryotes // J Chromatogr A. 2006. Vol. 1106, № 1-2. P .

80-8 .

96. Harada K., Fukusaki E., Kobayashi A. Pressure-assisted capillary electrophoresis mass spectrometry using combination of polarity reversion and electroosmotic flow for metabolomics anion analysis // J Biosci Bioeng. 2006. Vol. 101, № 5. P .

403-9 .

97. Wunschel D., Fox K.F., Fox A., et al. Quantitative analysis of neutral and acidic sugars in whole bacterial cell hydrolysates using high-performance anionexchange liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry // J Chromatogr A. 1997. Vol. 776, № 2. P. 205-19 .

98. Villas-Boas S.G., Mas S., Akesson M., et al. Mass spectrometry in metabolome analysis // Mass Spectrom Rev. 2005. Vol. 24, № 5. P. 613-46 .

99. Shi G. Application of co-eluting structural analog internal standards for expanded linear dynamic range in liquid chromatography/electrospray mass spectrometry // Rapid Commun Mass Spectrom. 2003. Vol. 17, № 3. P. 202-6 .

100. Fernie A.R., Trethewey R.N., Krotzky A.J., et al. Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology // Nat Rev Mol Cell Biol. 2004. Vol. 5, № 9. P .

763-9 .

101. Шатц В.Д., Сахартова, О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии // Рига: Зинатне. 1988. C. 390-9 .

102. Wilson I.D., Plumb R., Granger J., et al. HPLC-MS-based methods for the study of metabonomics // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005. Vol .

817, № 1. P. 67-76 .

103. Jandera P. Stationary and mobile phases in hydrophilic interaction chromatography: a review // Anal Chim Acta. 2011. Vol. 692, № 1-2. P. 1-25 .

104. Vo Duy S., Besteiro S., Berry L., et al. A quantitative liquid chromatography tandem mass spectrometry method for metabolomic analysis of Plasmodium falciparum lipid related metabolites // Anal Chim Acta. Vol. 739, № P. 47-55 .

105. Bajad S., Shulaev V. LC-MS-based metabolomics // Methods Mol Biol. 2011 .

Vol. 708, № P. 213-28 .

106. Harder U., Koletzko B., Peissner W. Quantification of 22 plasma amino acids combining derivatization and ion-pair LC-MS/MS // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. Vol. 879, № 7-8. P. 495-504 .

107. Орлов В.И. А.А.А. Жидкостная хроматография. Теоретические основы: / ed .

Научно-технологическая компания // Дзержинск: Синтенко. 1997. C. 37-9 .

108. dos Santos Pereira A., David F., Vanhoenacker G., et al. The acetonitrile shortage: is reversed HILIC with water an alternative for the analysis of highly polar ionizable solutes? // J Sep Sci. 2009. Vol. 32, № 12. P. 2001-7 .

109. Coulier L., Bas R., Jespersen S., et al. Simultaneous quantitative analysis of metabolites using ion-pair liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 18. P. 6573-82 .

110. Tolstikov V.V., Fiehn O. Analysis of highly polar compounds of plant origin:

combination of hydrophilic interaction chromatography and electrospray ion trap mass spectrometry // Anal Biochem. 2002. Vol. 301, № 2. P. 298-307 .

111. Tolstikov V.V., Fiehn O., Tanaka N. Application of liquid chromatography-mass spectrometry analysis in metabolomics: reversed-phase monolithic capillary chromatography and hydrophilic chromatography coupled to electrospray ionization-mass spectrometry // Methods Mol Biol. 2007. Vol. 358, № P. 141-55 .

112. Olsen B.A. Hydrophilic interaction chromatography using amino and silica columns for the determination of polar pharmaceuticals and impurities // J Chromatogr A. 2001. Vol. 913, № 1-2. P. 113-22 .

113. Guo Y., Gaiki S. Retention behavior of small polar compounds on polar stationary phases in hydrophilic interaction chromatography // J Chromatogr A .

2005. Vol. 1074, № 1-2. P. 71-80 .

114. Naidong W. Bioanalytical liquid chromatography tandem mass spectrometry methods on underivatized silica columns with aqueous/organic mobile phases // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003. Vol. 796, № 2. P. 209-24 .

115. Spagou K., Tsoukali H., Raikos N., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies // J Sep Sci. Vol. 33, № 6P. 716-27 .

116. Cubbon S., Antonio C., Wilson J., et al. Metabolomic applications of HILIC-LCMS // Mass Spectrom Rev. Vol. 29, № 5. P. 671-84 .

117. Bajad S.U., Lu W., Kimball E.H., et al. Separation and quantitation of water soluble cellular metabolites by hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry // J Chromatogr A. 2006. Vol. 1125, № 1. P. 76-88 .

118. Chauve B., Guillarme D., Cleon P., et al. Evaluation of various HILIC materials for the fast separation of polar compounds // J Sep Sci. 2010. Vol. 33, № 6-7. P .

752-64 .

119. Fu Q., Liang T., Li Z., et al. Separation of carbohydrates using hydrophilic interaction liquid chromatography // Carbohydr Res. 2013. Vol. 379, № P. 13-7 .

120. Naidong W., Chen Y.L., Shou W., et al. Importance of injection solution composition for LC-MS-MS methods // J Pharm Biomed Anal. 2001. Vol. 26, № 5-6. P. 753-67 .

121. Гюхнер Х. Введение в курс спектроскопии ЯМР: Пер. с англ. // Москва:

Мир. 1984. C. 365-9 .

122. Воловенко Ю.М. К.В.Г., Комаров И.В., Туров А.В., Хиля В.П .

Спектроскопия ядерного магнитьного резонанса для химиков // Москва:

Научное партнерство, МБФНП. 2011. С. 568-96 .

123. Coen M., Holmes E., Lindon J.C., et al. NMR-based metabolic profiling and metabonomic approaches to problems in molecular toxicology // Chem Res Toxicol. 2008. Vol. 21, № 1. P. 9-27 .

124. Fiehn O. Extending the breadth of metabolite profiling by gas chromatography coupled to mass spectrometry // Trends Analyt Chem. 2008. Vol. 27, № 3. P .

261-269 .

125. Putri S.P., Nakayama Y., Matsuda F., et al. Current metabolomics: practical applications // J Biosci Bioeng. Vol. 115, № 6. P. 579-89 .

126. Lewis I.A., Schommer S.C., Hodis B., et al. Method for determining molar concentrations of metabolites in complex solutions from two-dimensional 1HC NMR spectra // Anal Chem. 2007. Vol. 79, № 24. P. 9385-90 .

127. Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии: Методы в химии // Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2010. С. 100-76 .

128. Lacorte S., Fernandez-Alba A.R. Time of flight mass spectrometry applied to the liquid chromatographic analysis of pesticides in water and food // Mass Spectrom Rev. 2006. Vol. 25, № 6. P. 866-80 .

129. Hu Q., Noll R.J., Li H., et al. The Orbitrap: a new mass spectrometer // J Mass Spectrom. 2005. Vol. 40, № 4. P. 430-43 .

130. Glish G.L., Burinsky D.J. Hybrid mass spectrometers for tandem mass spectrometry // J Am Soc Mass Spectrom. 2008. Vol. 19, № 2. P. 161-72 .

131. Liebeke M., Dorries K., Meyer H., et al. Metabolome analysis of gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus by GC-MS and LC-MS // Methods Mol Biol. Vol. 815, № P. 377-98 .

132. Soo E.C., Hui J.P. Metabolomics in glycomics // Methods Mol Biol. Vol. 600, № P. 175-86 .

133. Kimball E., Rabinowitz J.D. Identifying decomposition products in extracts of cellular metabolites // Anal Biochem. 2006. Vol. 358, № 2. P. 273-80 .

134. Want E.J., Nordstrom A., Morita H., et al. From exogenous to endogenous: the inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics // J Proteome Res. 2007 .

Vol. 6, № 2. P. 459-68 .

135. Buescher J.M., Moco S., Sauer U., et al. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites // Anal Chem. Vol. 82, № 11 .

P. 4403-12 .

136. Luo B., Groenke K., Takors R., et al. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1147, № 2. P. 153-64 .

137. Cai S.S., Short L.C., Syage J.A., et al. Liquid chromatography-atmospheric pressure photoionization-mass spectrometry analysis of triacylglycerol lipids-effects of mobile phases on sensitivity // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1173, № 1P. 88-97 .

138. Hilario M., Kalousis A., Pellegrini C., et al. Processing and classification of protein mass spectra // Mass Spectrom Rev. 2006. Vol. 25, № 3. P. 409-49 .

139. Pedrioli P.G., Eng J.K., Hubley R., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research // Nat Biotechnol .

2004. Vol. 22, № 11. P. 1459-66 .

140. Sugimoto M., Kawakami M., Robert M., et al. Bioinformatics Tools for Mass Spectroscopy-Based Metabolomic Data Processing and Analysis // Curr Bioinform. Vol. 7, № 1. P. 96-108 .

141. van Nederkassel A.M., Daszykowski M., Eilers P.H., et al. A comparison of three algorithms for chromatograms alignment // J Chromatogr A. 2006. Vol. 1118, №

2. P. 199-210 .

142. Nordstrom A., O'Maille G., Qin C., et al. Nonlinear data alignment for UPLC-MS and HPLC-MS based metabolomics: quantitative analysis of endogenous and exogenous metabolites in human serum // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 10. P .

3289-95 .



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "ТОЛЬЯТТИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ СЕРВИСА (ТГУС)" А. И. БОЧКАРЁВ, Т. С. БОЧКАРЁ...»

«СОБОЛЕВ Сергей Викторович ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСТУРАЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ У ДЕТЕЙ МЛАДШЕГО ШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА С НАРУШЕНИЕМ СЛУХА 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЯСНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ПОРЯДОК САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ МОСКВА 1996 г строительные испытания РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК...»

«Актуальные статьи журналов, поступивших в мае-августе 2018 года • Обухов Д.К., Пущина Е.В., Вараксин А.А., Цехмистренко Т.А. Биология в школе Биология и медицина на рубеже XX-XXI вв. (продол...»

«Сведения об иностранных участниках РосХит-2018 – 16 участников Количество Данные участников, подтвердивших свое участие в Страна участников, мероприятии подтвердивших свое участие в мероприятии (цифрами) 1. Беларусь, г. 2 Куликовская Виктория Игоре...»

«ISSN 1561-1124 МАТЕРИАЛЫ ПО ИЗУЧЕНИЮ РУССКИХ ПОЧВ ВЫПУСК 10 (37) Санкт-Петербург САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА ПОЧВОВЕДЕНИЯ И ЭКОЛОГИИ ПОЧВ ЦЕНТРАЛЬНЫЙ МУЗЕЙ ПОЧВОВЕДЕНИЯ ИМ. В.В.ДОКУЧАЕВА МАТЕРИАЛЫ ПО ИЗУЧЕНИЮ РУССКИХ ПОЧВ ВЫПУСК 10 (37) Издание основано в 1885 г. А.В. Советовым и В....»

«Перчаточные боксы Basic 818–GB/GBB Компактные перчаточные боксы Basic 818-GB/GBB предназначены для научных исследований, требующих полную изоляцию исследуемого материала от о...»

«1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук СТЕНОГРАММА защиты диссертации Ермолаева Евгения Сергеевича на тему: "Особенности реакции кардиореспираторной системы человек...»

«ОТЗЫВ ОФИЦИАЛЬНОГО ОППОНЕНТА НА ДИССЕРТАЦИОННУЮ РАБОТУ УДАЛОВА И.А. ГОЛЫЕ ЛОБОЗНЫЕ АМЕБЫ РОДА KOROTNEVELLA GOODKOV, 1988 СИСТЕМАТИКА, БИОРАЗНООБРАЗИЕ И (AMOEBOZOA,PARAMOEBIDAE): ДНК-БАРКОДИНГ'', представленную на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности зоология 03.02.04...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Средняя общеобразовательная школа №1 г. Советский" СОГЛАСОВАНО" УТВЕРЖДЕНО Заместитель директора по учебно-воспитательной работе приказо...»

«Комментарии членов Правления ТСЖ "Вавиловых 9" к Акту по проведению ревизии финансово-хозяйственной деятельности ТСЖ "Вавиловых 9" от 25.04.2018 г. п.1 Акта ревизии: "Органы управления ТСЖ "Вавиловых 9": "Полномочия правления и председателя правления истекли 02.1...»

«Санкт-Петербургский государственный университет Биологический факультет Кафедра генетики и биотехнологии Трофимова Ангелина Викторовна Метилирование гистона Н3 в нейронах грибовидных тел мозга медоносной пчелы при об...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ФИЛИАЛ ИНСТИТУТА ИСТОРИИ ЕСТЕСТВОЗНАНИЯ И ТЕХНИКИ ИМЕНИ С.И. ВАВИЛОВА САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ СОЮЗ УЧЕНЫХ ИЗДАТЕЛЬСТВО "НЕСТОР-ИСТОРИЯ" ИСТОРИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Том 6 №3 Санкт-Петербург Главный редактор: Э.И. Колчинский Редакционная коллегия: Л. Акерт (Фила...»

«ГОСУДАРСТВЕННАЯ ДУМА ФЕДЕРАЛЬНОГО СОБРАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ СЕДЬМОГО СОЗЫВА ДЕПУТАТ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ДУМЫ № ?23 20 /3 г. Председателю Государственной Думы Федерального Собрания Российской Федерации В. В. Володину Уважаемый Вячеслав Викторович! Н...»

«Микросистема для вечеринок Sony GTK-N1BT 1. Тип товара: аудиосистема 2. Характеристики Конструкция: Акустическая система: 1Way Сабвуфер АС: 160 мм (3) Широкодиапазонный динамик: 65 мм 2(8) Выходная мощность — фронт. (RMS 10%...»

«Курс по "Глобальной энергетике" ЭНЕРГИЯ И ЭНЕРГЕТИКА В.А. Грачев, научный руководитель Центра глобальной экологии факультета глобальных процессов МГУ им. М.В. Ломоносова, профессор, д.т.н., член-корр. РАН ВВЕДЕНИЕ В начале XXI ве...»

«Vol. 3 (1), 2018 УДК 574.42 DOI 10.21685/2500-0578-2018-1-5 RESEARCH ARTICLE Open Access ECOLOGICAL MODELING OF LOCUSTA MIGRATORIA L. BREEDING CONDITIONS IN SOUTH-EASTERN KAZAKHSTAN1 D. V. Malakhov National Center for Space Research and Technology, Almaty, 050010, Republic of Kazakhstan E-mail: d_malakhov_73@mail...»

«АЭРОТОЛЕРАНТНОСТЬ СТРОГО АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА (ОБЗОР) © 2007 г. А.Л.Брюханов, А.И.Нетрусов Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва 119991;...»

«УТВЕРЖДЕН Годовым общим собранием акционеров ОАО "ОХК "УРАЛХИМ" протокол № 16 от 03.06.2010 года УТВЕРЖДЕН (предварительно) Советом директоров ОАО "ОХК "УРАЛХИМ" протокол № 14 от 04.05.2010 г...»

«В Звенигороде состоялась вторая зимняя научная школа "Современная биология & биотехнологии будущего" C 26 января по 1 февраля 2014 года в Подмосковье прошла зимняя научная школа "Современная биология & биотехнологии будущего", которая уже второй раз собрала молодых ученых из разных...»







 
2019 www.librus.dobrota.biz - «Бесплатная электронная библиотека - собрание публикаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.